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電気泳動 CBB染色 脱色液方法について
理系大学生です 電気泳動のCBB染色後の脱色液のことで二つ質問があります 脱色液の組成について、一般的にはエタノール(またはメタノール)約25%、酢酸約7.5%を用いられますが、5%程のTCA溶液を代わりに用いてはいけないでしょうか と言いますのも、低分子のタンパク質の染色が悪いのでこのように脱色液の組成を変更したところ染色できるように成りました。しかし、染色結果を定量的に評価する際に問題ないのかが分かりません 二つ目は、有機溶媒を溶かした脱色液である程度脱色を行った後は、蒸留水を用いて脱色をしてはいけないのでしょうか よろしくお願い致します
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No.2です。 定量精度低下には繋がらないでしょう。 5%TCAで精度が疑われるのなら、通常の脱色液（エタノール＋酢酸）でも然りです。 もちろん、染始めや完全に脱色してしまった後は精度云々の話ではなくなります。 脱色は、タンパク質がない部分のバックを減らすのが目的ですので、バックが無視できる濃さ （バンドがキレイ確認できる濃さ）になれば、定量することができるでしょう。 CBBのバンドを定量するのは、主に目玉ですが、バンドの濃さと太さを定量してくれるソフトもありますね。 データを客観視するなら、このようなソフトを使うのが良いと思います。 CBBやウェスタンのバンドを定量化してグラフを描いたりしている論文もありますが、バンドを囲う時にバイアスも多少かかるでしょうから、あくまでCBBでの定量は、「バンドの定量値」としてお考えになるのが良いと思います。 バンドが複数で目的のタンパク質にタグが付いているならタグによる精製、分子量が違うならゲル濾過後に定量、トータルタンパク量で良いならUVやBCA基質でのタンパク質定量もできます。 CBBでの定量だけに拘らず、他の方法でも目的のタンパク質を定量できるのであれば、定量することをお勧めします。 その方が人を説得させられるし、先入観のない正しいデータを出すことができます。 ではでは、頑張ってください。
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- browntraut
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２種のご質問に対し、いっぺんにお答えします。 まず、脱色したい溶液にCBBが溶解可能かどうかを調べる必要があります。 容易に溶けるのであれば、その溶液を脱色液にすることは可能でしょう。 つまり、5%程のTCA溶液にCBBがグングン溶けるのではれば、可能ということになります。 たしか、CBBは水にあまり解けなかったのではと思います。 机についたCBBのシミを落とすのも、水よりはエタノールの方がすぐに拭えますからね。 つまり、蒸留水を脱色とするのはあまり賢明ではないということになります。 熱水だと多少はマシかもしれませんが、アクリルアミドゲルが脆くなるので、そこは注意です。
お礼
回答ありがとうございます CBBの溶媒への溶解度についてですが、私が実験をして確認をしたところ5% TCA溶液へ溶解可能です。ただし、溶解度はそれほど高くはないです ひとつお聞きしたいのですが 溶解度が低いことが定量解析にも問題となるのでしょうか つまり、溶媒へのCBBの溶解度が低いことは脱色効率の低下だけでなく、定量解析の精度低下にもつながるのでしょうか よろしくお願い致します
TCA溶液ってタンパク質の変性作用がとても強いので、 そんなものを使ったら定量分析にならないように思います。 CBB染色の感度が弱いのであれば、より感度の高い銀染色 を検討すべきではないでしょうか。
お礼
回答ありがとうございます タンパク質への強い変性作用があることがいけないとのことですが、このことに関する以下の疑問点について教えていただけますか ゲル内のタンパク質はSDSと混合した際に、すでに完全に変性していると思います そもそも、脱色液に含まれている有機溶媒はタンパク質を変性させ、析出させることが目的だと思うのですがいかがでしょうか もしくは、変性作用が強すぎると、タンパク質量の定量解析に悪影響を及ぼすということでしょうか また、銀染色についてですが、定量解析を行いたいので現在のところ検討はしておりません よろしくお願いいたします
お礼
回答ありがとうございます 評価法について、様々なご指摘ありがとうございます 本実験の都合上、この手法で続行しようと思います 私自信もCBB染色後にフリーソフトを用いてバンドの定量化を行い、この結果を元にタンパク質の定量化を行おうと考えていたところです笑 おかげさまで、懸念点が解決して実験が一つ前進しそうです ありがとうございました