透明標本の、軟骨染色に関して

質問

高校の部活で、透明標本を用いて研究をしている者です。

タイトルの通り、軟骨染色に関して質問があります。
アルシアンブルーで染めているのですが、比較的浅い部分の軟骨しか染まらなかったり、ムラができたりしてしまいます。
長時間液浸すれば解決するのかもしれませんが、硬骨の脱灰が起こる上に、過染色もひどくなってしまうので困っています。

染色方法は、ホルマリン固定後にサンプルを一度エタノール置換し、その後、エタノール：酢酸＝７：３の溶液にアルシアンブルー液適量を加えた染色液に数時間程度液浸する、といったものです。
(アルシアンブルー液は、3%酢酸水溶液1000mlにアルシアンブルー8GXを10gを溶かしたものらしいです。一回の使用量はかなり少なめです。http://www.drug.co.jp/products/p-11222.html　)

上記の方法に改善点があれば教えて頂きたいです。
また、軟骨染色液にエタノールを利用する意味についても、ご存知でしたらお願いします。
(顕微鏡観察用切片標本の作製時には、酢酸水溶液や塩酸水溶液を使用するようなので。。。)

よろしくお願いします。

回答No.5

tokusa01

こんにちは
透明標本の作製を始めたばかりで、まだ数センチ程度の魚しかうまくいっていませんが、軟骨染色は難しいですね。
アルシアンブルーによる軟骨染色をいろいろ条件を変えてテストしてみましたが、以下は「私が魚で」試した結果から分かったことです。
酢酸濃度5、10、20%の3条件(残りはエタノール)どれでも染色は可能。
酢酸濃度を下げるとヒレの先端が青く染まる。(若干過染色？)
酢酸濃度を下げると脱灰を防げる。
染色時間だけでなく、温度も染色と脱灰に影響する。
酢酸と水の組み合わせでは脱灰する。
ホルマリンの固定時間が長すぎると軟骨染色時に全体が青く染まる。(過染色)

参考になるかどうか分かりませんが、お互いがんばりましょう。

余談ですが、私の手元にレジンで固められたスズメの二重染色透明標本があります。
染色具合もレジンの固定も見事ですが、これは当時高校の理科の先生だった私の叔父が26年前に作ったものです。
先日数年ぶりに叔父に会ったときに、まさかそこまではやっていないだろうと思い透明標本の話をしたところ、昔やっていたと聞かされて驚き、さらにレジン漬けのスズメを見せられて「参りました」と頭を下げました。
当面は叔父が私の目標です。

お礼

貴重な回答ありがとうございます。様々なことを試されているようですね。
僕もまだまだ予備実験が不足しているなあと改めて感じました。今後の予備実験の参考にさせて頂きます。

叔父様、すばらしい方ですね。お互いに、追いつける日が来ることを願っています。

回答No.4

creatureclub

こんにちは、リンク元検索から来ました。
http://creatureclub.web.fc2.com/niwatori/niwatori2.html
僕たちの実験も決してうまくいっているわけではないんですが(汗)、回答させてください。

軟骨染色にムラができてしまうということでしたが、下の回答補足にもあるように、エタノールの置換に問題があるかもしれません。ただ、エタノールについては正確なことが分からないのも事実です。置換の割合や軟骨染色溶液の比率を少しずつ変えながら予備実験を重ねてみてください。
染色の際、詰め込みすぎないことも染色成功のコツかもしれません。

明確な回答になっていなくてすみません。透明骨格標本の実験はいろいろなやり方があって、どれが成功への近道なのか迷ってしまうことも多いです。ニワトリ胚を使われているようですね。お互い地道に予備実験を重ねていきましょう！

参考URL：

http://creatureclub.web.fc2.com/niwatori.html

補足

回答ありがとうございます。

確かに、作製者によって実験工程にかなり差がありますし、地道な予備実験は必要だと感じます。
http://www.agri.tohoku.ac.jp/bioinfor/prot5-6.pdf
↑東北大学大学院農学研究科、生物生産情報システム学分野の実験プロトコル(軟骨・硬骨二重染色)

こちらのリンクでは、一般的に良く見る染色手順と異なり、透明化処理の後に軟骨染色をすると記述されています。使用されている酵素もProteinase　Kというもので、トリプシンではありません。

研究が成功するように今後も精進します。そちらもがんばって下さい！

回答No.3

thegenus

詳しくない回等者に、ご丁寧なお礼をして頂き、恐縮です。
礼儀正しさは日本で研究活動する上で大切な作業であり、あなたには成功する研究者の素質があります。
もちろん礼儀正しさと自分のやり方を捨てられるかは別ですが。

前言した、いろいろ試された方がいいというのは撤回させてください。本命の実験は休止して実験計画を作り直した方がいいのではないでしょうか。
http://creatureclub.web.fc2.com/niwatori/niwatori2.html
エタノール使用の問題については私も関心のあるところですが、透明標本に成功している人がその答えを知っているでしょうか。スポーツや料理、技術職において、成功する事と説明できる能力は違います。自転車に乗れない人が自転車の倒れない原理が気になってその理屈を研究しても乗れないままだと思います。

今のところ塩酸を用いる方法はしない方がいいように思います。収拾がつかなくなると思います。一般的なやり方で成功させる方が技術的に孤立しないで済みます。

あなたは一人でされているのでしょうか。顧問は生物の先生でしょうか。その先生は透明標本に成功されているのでしょうか。たとえノーベル賞学者でもしていない事は、成功させた事のある人に劣ります。軟骨の研究者であれ、透明標本作りの経験がなければ、想像の回答になります。あなたのプロトコルは何を元に作られていますか。

あなたのプロトコルを補足欄に書いてください。あなたのためになります。一つアバウトにすると結局全部アバウトになって、キーポイントの作業で一番ミスをおかしやすくなります。ちなみにプロトコルなどという言葉は誰から学んだのですか。理科の学力低下が騒がれている一方で、現実はもはや高校生が研究者言葉を使っているのですかね。

そのプロトコルに忠実に行って、上手く行かない場合、その記載にない要素が原因です。あなたはそれをみつけなければなりません。違いがあるから成功しないのです。それは実につまらないことかもしれません。お茶の作法のように手習いしないと自分流のミスをおかしてしまいます。それは並んで実験作業しないと発見できな様な勝手の違いなどになります。成功した人が最適のプロトコルを掲載できるとは限りません。成功した人のプロトコルを忠実に模倣して、それでも上手く行かないというのは、有り得ないことですよね。ですから他の方法への移行、たとえば塩酸の使用は延期された方がいいと思うのです。何が違うのかを知るには頭を使うのではなく、成功した人に接触することです。自分の研究室に埋没したらいけません。言葉だけでも不十分で、言外の要素に成功者と失敗者の違いがあります。課外学習としても将来的な研究姿勢としても、成功者に会われる事をお勧めします。大学や企業の研究室で、研究が進むのは、そこに出来る人がいるからです。出来る人がよそにいる事をプロトコルだけで始めるとなかなか上手く行きません。そのため、活発な交流をしている研究室の方が成功します。高校の部活動で、あなたが上手く行かないのはむしろ当たり前です。日本透明標本学会もないのでしょうから、孤立した若い研究者は袋小路におちいります。学会の年会費や文献の書籍代や失敗する試薬代を、交通費に当てた方が、研究者の姿勢として正しいのです。あなたは、すでに成功例のある実験を再現したいのですよね。それに失敗しているのならば、これ以上、一人でやるのは、大間違いです。

ニワトリ胚などとありますが、列挙されるべきです。成功した動物と失敗した動物があるのですか。ちなみにニワトリ胚はどのように手に入れているのでしょう。予備実験の成功が第一段階です。透明化に関する課題もあると思いました。具体性のあるプロトコールを作成してください。

塩酸に浮気する前に、もろもろの失敗要素が考えられますよね。計画の練り直しです。授業を休んででも成功者に会うことをお勧めします。

補足

そうですね・・・。再三ありがとうございます。

回答No.2

thegenus

学校の道具および部費でされているのでしょうから思うように条件を変えてみて、平行して研究を進めてみたらどうでしょうね。その結果の差を見るのも研究だと思います。

http://www1.cncm.ne.jp/~itoyama/kokkaku.html
中学生。私費で購入したのでしょうね。

http://www.s.kaiyodai.ac.jp/museum/public_html/exhibitions/exhib_fishes_sub/column_fish_skeleton.htm

これらはご指摘の意味での、エタノール置換や脱水とやらをしているのでしょうか。

※経験者に問い合わせたらどうでしょう。

作業手順について
↓
時間などをはっきりと記載された方が
↓
他の読む人にとってもあなた自身にとっても
↓
改善点が見えてきやすいと思います。→再現性が重要ですね。
↑
何の軟骨を染めようとしているのですか。

これまでにどんな動物で、成功または失敗されたのですか。

硬骨の問題よりも、まずは軟骨の染色を優先させたらどうでしょう。過染色というお話は、深い組織が少しも染まらずに、浅いところばかり濃く染まるというこですかね。組織像ではなく、組織の局在が肉眼的に見られたらいいのですよね。

ご指摘の切片標本は数打て当れという感じですかね。とりあえずは良い部分だけ見られるような標本を完成させてみてから完成度を高めるという心積もりも悪くないと思います。

しっかり記録を取りながら、忠実な手順を踏んで、いろいろ試されたらいかがでしょう。

頑張って下さい。詳しいことが分からず申し訳ないです。

補足

エタノール置換については、作製者によってまちまちだと思われます。
しかし、今のところ透明標本について、軟骨染色液にエタノールを使わない方法は発見出来ません（エタノール・酢酸の混合液にアルシアンブルーを溶かします）。
私たちの部活でも、エタノールを水に変えた染色液を試したことがありましたが、やはり失敗しました。

過染色、というのは、後の透明化処理以下を行っても、着色した筋肉等の着色が落ちなくなってしまうことです。
また、軟骨染色液への液浸時間は半日程度、サンプルにはニワトリ胚などを使用しております。
説明が足りない事ばかりで申し訳ありません。

ご指摘の通り、まず軟骨の染色を優先しようと考えています。
コンドロイチン硫酸とアルシアンブルーの結合の特異性は、pH1以下で上がるようなので、今後は塩酸を使った方法も試す予定です。
http://www.agri.tohoku.ac.jp/bioinfor/prot5-1.pdf
東北大学大学院農学研究科、生物生産情報システム学分野の実験プロトコル（軟骨染色）

様々な貴重なご指摘、ありがとうございますm(_ _)m

回答No.1

noname#212058

試料の脱水がうまくいっていないのではないでしょうか？ 以下のページを参考にしてみてください。
http://www.higo.ed.jp/sh/mifunesh/04_bukatsu/seibutsu/seibutsu_tomei.htm

補足

回答ありがとうございます。
リンク先も以前拝見したことがあります。

やはり試料の脱水が大事なのでしょうか？標本の作製を始めたころには、脱水せずに染色液にサンプルを液浸していましたが、そのころもあまり深くない部位の軟骨は染まりました。

また、顕微鏡用切片標本の染色では酢酸または塩化水素水溶液を用いていることや、液浸時間を長くすることで軟骨が染まりやすかったことから、色素がうまく浸透していなかったのではと考えたのですが。

やはり透明標本用の染色では、エタノールで脱水後に液浸したほうがいいのでしょうか。また、染色液にエタノールを用いることには、どのような意味があるのでしょうか。

乱文申し訳ありません・・・。