プレートリーダーでの蛍光測定について

質問

近々、96穴プレートを使って接着細胞の蛍光を測定する実験を組もうと思っています。プレートリーダーの使用は初めてなので分からないことが多く、もしご存知の方がいらっしゃいましたら教えて頂けたらと思います。

１．よく使われる励起時間は何秒くらいでしょうか（機械のデフォルトでは0.4sでしたがこれが一般的なのでしょうか）。

２．蛍光の数値化に関して、励起の始めと終わりの差を測定する「Delta」という設定と、励起の始めから終わりまでの平均を測定する「Mean」という設定の選択があるのですが、違いがよく分かりませんでした。選択する判断基準は何でしょうか。

３．最後に初歩的な質問ですが、蛍光の測定中は96穴プレートのフタをしないほうがいいのでしょうか。

どれか１つでも構いませんのでご教授いただけたらと思います。
宜しくお願い致します。

回答No.1

larme001

蛍光の測定で問題になるのは、自家蛍光がどの程度あるのかということとメディウム等によって蛍光と励起光が吸収されてしまうバックグラウンドの問題でしょう。その上で様々な点での実験誤差を考慮してあなたの求めている実験条件で再現性よく評価出来るかどうかを個別の事象に対して検討する必要があるでしょう。つまり、「こうしたから絶対大丈夫」というのは難しく、結局は目的とする系に対してどの程度再現性があるのかとか、実験から何を評価したいのかを試行錯誤して最適化する必要があるということです。もちろんあなたの言うポイントもあればそれ以外にも無数に条件なんて考えられますし、そもそもプレートリーダで行うスループットの前の段階での条件検討が必要な場合だってあるでしょう。
　一般的には、蛍光自体はかなり線形性が高いものですし、ウエスタンブロッティングで蛍光抗体を用いるとかなり定量性もあるように言われています。ただ、上記の理由から生きた細胞レベルで直接定量化するのは難しい場合もおおいので、たとえばレポーターアッセイなんかではルシフェラーゼ（発光）が使われていますが、これはルミノメーターなどのフォトンカウントによって初めて定量性があると言えます。

　まあ、もしGFPかなんかで定量化するような場合ならドラッグスクリーニングのようなかなりのスループットを要するようなものでないならFACS等で測定する方が良いようにも思います。細胞単位での変化も見えますし。どうしてもスループットにこだわるなら定量性というよりも光るか光らないかのようなかなり定性的な実験が妥当なところかもしれません。

　いずれにせよ、参考にしている元となる実験系があるでしょうから、それらのプロトコールを何個もあたってみてあとは自分で検証するしかないでしょうね。