リアルタイムPCRで偽陽性？

質問

リアルタイムPCRで病原体の検査を確立しています。
最初は検査の結果が問題なくいっていましたが、本日の試験で
陰性検体と陰性コントロールで増幅曲線を示ました。CT値は37～40の値を示します。
このような現象は、全ての検体ではなく、10検体中5検体で、陰性コントロールは全て起こりました。
原因は、試薬あるいはピペットが汚染したからでしょうか？
ご存じの方、ご指導お願いします。

回答No.1

noname#160718

同様の仕事をしています。

　まず間違いなくコンタミでしょう。
　陰性検体ならまだしも、陰性コントロールで増幅が起きるということは、陰性コントロールのwellに増幅され得るテンプレートが混入したことを意味します。
　それが陽性検体からのDNAなのか、関係ない非特異DNAなのかはCYBR-Green法でやっておられるのでしたら解離曲線を見れば判ります。
　まあいずれにしろ、陰性コントロール検体で増幅が見られた時点で、その検査全体が成立せず棄却しなければなりませんけど。

　何が汚染したか、は判りません。ざっと考えられるだけでもピペット、PCRキットの試薬、プライマーやプローブ、量の調整に使う水あたりでしょうか。
　ピペットが汚染したことによる１回限りのコンタミなら良いのですが、プライマーや試薬がコンタミしていると少々やっかいです。（でもピペットが汚染されるとたいてい試薬か何かが汚染される）

　調べる方法は、試薬、プライマー、プローブ、水など汚染が疑われるモノを１つずつ替えながらPCRをしていく以外にありません。面倒ですが仕方ないですね。

　リアルタイムＰＣＲは電気泳動がないのでコンベンショナルなＰＣＲより格段にコンタミのリスクは少ないです。電気泳動槽中のバッファって、もの凄く濃厚なコンタミ源ですから。
　ですからリアルタイムＰＣＲでコンタミを起こしたということは、多くの場合は技術的に未熟であることに原因があることが多くいです。

　コンタミ源の調査と同時に、ご自分の作業をもう一度念入りに点検することをお勧めします。