RAW264.7細胞へのトランスフェクション

質問

RAW264.7細胞へのトランスフェクション
分子生物学的実験初心者です。よろしくお願いします。

RAW264.7細胞を用いたルシフェラーゼアッセイを行うために、プラスミドのトランスフェクションを試みています。
Lipofectionの試薬としてはFuGENEHDを用いています。
RocheやPromegaのサイトの推奨条件の通りにRAW264.7細胞にトランスフェクションを行っていますが、メーカーの出している数値のようなトランスフェクション効率が得られません。
メーカーでは40-50%のトランスフェクションが得られるとしていますが、自分の実験では5-10%程度です。

実験時に参考にしたPromegaのサイト
http://www.promega.com/techserv/tools/FuGeneHD/default.htm

RAW264.7細胞を用いてトランスフェクション実験をされている方で、トランスフェクション効率を上げるための何かコツのようなものがありましたら、教えていただけないでしょうか。

FuGENE、また他の試薬（Lipofectaminなど）でのトランスフェクションのいい方法がありましたら、教えて下さい。よろしくお願いします。

回答No.3

otx

ということは、

最初の補足で言っている実験では、
EGFPでは70-80%のトランスフェクション効率だった。

二番目の補足で言っている実験では、
EGFPでは５－１０％のトランスフェクション効率だった。

ということでしょうか？？？

要するに、トランスフェクションが安定しない、ということでしょうか？？

もしそうならば、細胞の状態に気を配って下さい。
トランスフェクション後、死んだ細胞が多かったりしませんか？
細胞の維持というのは難しいものです。

補足

舌足らずな説明で申し訳ないです。
２つの細胞を用いて実験を行いました。
まず293T細胞を用いて実験を行い、その後RAWcellを用いて実験を行いました。

最初の293T細胞を用いた実験では、ルシフェラーゼアッセイはうまくworkしました。EGFP発現ベクターによるトランスフェクション効率も70-80%と良好でした。
その後、RAWcellに対して同じプラスミドを用いてルシフェラーゼアッセイを試みているのですが、そのRAWcellを用いた実験がうまくいっていません。
うまくいかない主な理由として、RAWcellの実験で十分なトランスフェクション効率が得られていない、ということが考えられ、トランスフェクション効率を上げる方法に関して、ここに質問した次第です。

回答No.2

otx

>transfection効率は、EGFP発現ベクターを用いて蛍光顕微鏡下で確認しました。

そうでなくて、

＞自分の実験では5-10%程度です。

「自分の実験」とはルシフェラーゼアッセイを行なうためのトランスフェクションではないのでしょうか？
その効率が5-10%程度とおっしゃっているのではないですか？

そのルシフェラーゼアッセイのために行なったトランスフェクションが5-10%程度と、どのようにして確認したのか？
ということです。

補足

誤解を招く表現でした。
ルシフェラーゼ活性評価のための「自分の実験」では、トランスフェクション効率を直接評価はしていません。
目的のルシフェラーゼ活性、pRL-TKの活性ともバックグラウンドと全く変わらないため、トランスフェクションはほとんど出来ていないもの、と判断しました。

トランスフェクション効率を評価するため、「自分の実験」に用いたプラスミドとは別に、EGFP発現ベクターを用いてトランスフェクションを行い、その際に確認したトランスフェクション効率が５－１０％でした。

※「自分の実験」で用いるルシフェラーゼベクター、ｐRL-TKとも293T細胞ではうまくトランスフェクションされて、workすることは確認しています。（その際の、そのベクター自体のトランスフェクション効率は確認していませんが、、、)

回答No.1

otx

＞自分の実験では5-10%程度です。

どうやってこうの数値を出したのでしょうか？

補足

transfection効率は、EGFP発現ベクターを用いて蛍光顕微鏡下で確認しました。

同じFuGENEを用いて同様のプロトコールでEGFP発現ベクターを293T細胞にトランスフェクションした時は、70-80%のトランスフェクション効率が得られました。
試薬や手技には大きな問題はないものと思っています。