DNAクローンと過剰発現について

質問

すみません。初歩的な質問ですが、混乱しています。

特定のヒト遺伝子をE.coliに発現させる場合、
DNAフラグメントをプラズミドに挿入してトランスフェクションするは分かるのですが、挿入するDNAフラグメントはある程度特定できるものなのでしょうか？全てのフラグメントとなると膨大な数になってしまいますが、かといって特定方法がわかりません・・・。

また、その遺伝子をE.coli内で過剰発現させる場合、強力なプロモーターを使うことは想像つくのですが、DNAをプラズミドに挿入する時に一緒に混ぜてしまえば良いのでしょうか？何処でどう組み込めばいいのか、こちらも方法がよくわかりません。

分かる方ご回答頂けると助かります。宜しくお願いします。

回答No.3

stringf35 · ベストアンサー

ヒトの染色体を切り刻んで全部プラスミドに挿入してから、「特定の
遺伝子」が入ったプラスミドを探すようなイメージを持っていらっしゃる
のでしょうか？「特定の遺伝子」を発現させたい場合は、そんなことは
しません。

多くの場合、プラスミドに挿入したいｃＤＮＡをあらかじめＰＣＲなどで
増幅したうえ精製しておくので、「特定の遺伝子」が選択的に組み込まれ
ます。

プロモーターに関しては、市販のプラスミドの遺伝子挿入部位（マルチ
クローニングサイト）の上流に、あらかじめプロモーターが組み込まれて
いるので、挿入する遺伝子に組み込んでおく必要はありません。

お礼

回答ありがとうございます。

すみません、まさにそのイメージを持っていました。
なるほど、cDNAを使えば良いのですね。
市販プラズミドの存在も知りませんでした・・・。
無知で申し訳ないです。

もうひとつ疑問に思ったのですが、もし未知の細菌の染色体から全てのORFを取り出してE.coli等で発現させたい場合は先にcDNAライブラリを作成すれば良いのでしょうか？

回答No.4

stringf35

＞もし未知の細菌の染色体から全てのORFを取り出してE.coli等で
発現させたい場合は先にcDNAライブラリを作成すれば良いのでしょうか？

理論的にはその通りです。

しかし、cDNAライブラリーはmRNAから逆転写して作製するため、
何か特別なときにしか発現しない遺伝子や、常に発現していても
mRNAが非常に少ない遺伝子などは欠落する可能性があります。

また、ORFと書かれていますが、開始メチオニンから終始コドンまでの
いわゆる完全長cDNAを得ることは技術的な制約から（cDNAが非常に
大きい場合など）遺伝子によっては難しいこともあります。

そんな事情がありますので、「全てのORF」を含むcDNAライブラリーを
作製することは不可能ではありませんが難しく、もしできた場合には
それだけでかなり重要なリソースとなり得るものです。

お礼

なるほど・・・良くわかりました。
御丁寧な回答に感謝致します。助かりました。

こんな未熟な質問にお付き合い頂きまして、ありがとうございました。

回答No.2

otx

誠に申し訳ありません。
質問者様の日本語がよくわかりません。

「フラグメント」とはどういう意味で使われているのでしょうか？

「特定方法」とはどういうことを指しているのでしょうか？

＞何処でどう組み込めばいいのか、こちらも方法がよくわかりません。

質問者様は、「制限酵素」「ライゲーション」「マルチクローニングサイト」という単語をご存知でしょうか？

補足

こちらこそ申し訳ありません。
英語で学んでいるので、対応する日本語がわからないのです。

フラグメントは制限酵素で切断されたDNAという意味で使用しました。
ヒトの全てのDNAを切断した場合膨大な数になるので、
そのフラグメントを使用してプラズミドを作ってテストするとしたら大変な労力だろうと思ったのです。
そこで前もって、取りだしたい遺伝子が含まれているであろうフラグメントのみに数を減らすことは可能かどうか聞きたかったのです・・・。これでわかるといいのですが・・・。

二つ目の質問は、ごめんなさい日本語間違えました。
どのタイミングで、とお聞きしたかったのです。すみません。
挿入する方法はわかりました。ありがとうございます。

回答No.1

masatoshio

挿入するDNAフラグメントは、当然、目的に沿って「特定」されていませんか？　「特定のヒト遺伝子」ですから、既に特定されているものと思うのですが、どういう事でしょう。

もし、そのフラグメントがプラスミドに挿入されているかどうか特定する、という事ならば、挿入処理をしたプラスミドを用いて挿入したDNA配列と挿入予定部位をまたいだプラスミド配列を含む部位でPCRを掛けて確認するなどの方法があります。
また、プラスミドに挿入されたフラグメントがE.Coliにトランスフェクションされているかどうかは、抗生剤培地を用いてフィルタリング(薬剤耐性部位のあるプラスミドを用いたとして)して確認する形になります。

プロモーターは、通常は挿入するフラグメントにあらかじめくっつけて置いてから、プロモーターとフラグメントの複合体をプラスミドに挿入する形にするものかと思います。

お礼

回答ありがとうございます。
フラグメントの特定についてですが、言い方が悪かったようで、すみません。
沢山あるDNAフラグメントの中から挿入前に目的のヒト遺伝子の目安をつけることは可能か、とう言う意味です。DNAを取りだす時点である程度絞り込まれているのでしょうか？細菌の染色体を取り出して酵素で切り刻んで、とういうケースしか知らないのですが、ヒトだと莫大な数になってしまうと思ったので・・・。