クロラムフェニコールで選別するトランスフォーメーション

質問

クロラムフェニコール耐性であるプラスミド（ベクターはpOTB7）の量を増やそうと、30μg/mlクロラムフェニコールプレートにトランスフォーメーションをしたのですが、よく見ると細かいコロニーが大量に生えてしまい、とても成功したようは見えません。新しく作成したクロラムプレートを使っても同じ結果になりました。ちなみに使用しているコンピテントセルは、ストラタジーンのXL10-Gold® Ultracompetent Cellsです。初心者なのでよくわからないのですが、クロラムフェニコールで選別するときにはIPTGをあらかじめプレートに塗っておく必要があるのでしょうか。また、使用するベクターによって使用可能なコンピテントセルが決まっていたりするのでしょうか。ちなみにアンピシリンプレートを用いたトランスフォ－メーションコントロールは非常にはっきりとしたコロニーが生えています。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

>しかし遺伝子型を確認して見たところ、Tet^rのみのようです。
これと違うんでしょうか。質問文でXL10-Goldのあとに文字化けがあるので確証がないですが（インターネット上で機種依存文字の類は使わないようにしましょう）。
http://www.stratagene.com/products/displayProduct.aspx?pid=282

XL10-Gold Kan^rという派生系統でない、ただのXL10-Goldならば、クロラムフェニコール耐性です。遺伝子型のF'上の因子（F'に続く[ ]内）をよく見てください。形質転換体をクロラムフェニコールで選択する場合はXL10-Gold Kan^rを使えという但し書きもありますね。

お礼

すいません。ただのXL10-Goldのことでした。
遺伝子型の読み方を勉強します。では、XL10-Gold Kan^rを新たに購入して使用してみます。とても助かりました。どうもありがとうございます。

回答No.4

Dr_Hyper

ちゃんとお使いの株のことを調べてませんが、クロラムフェニコール耐性株をつかっているのでplasmidが入ろうがはいらまいが大腸菌が生えてきてしまっているように思います。または、Goldを使っているため効率が良すぎて生えすぎている（plasteの上に大腸菌が増えているのではなくて、うっすら撒かれた大腸菌の上に、さらに大腸菌が生息している状態）可能性もないとは言えません。
遺伝型を調べるのがめんどうであれば、ベクターを入れずに同様の処理したcompetent cellを撒いてみて確認してください。何も生えてこなければ使えるということですよね。
蛇足ですが学生が自前でcompetent cellを作製するときなど、このような確かめ実験をしてplasmidがコンタミしていないことを、またはcompetent cellが薬剤耐性になっていないかどうかを確認するのに使います。

お礼

ご回答ありがとうございます。遺伝型を調べてみたら、クロラムフェニコール耐性でした。新たにコンピテントセルを購入してやってみます。
また、ベクターを入れないコントロールも行ってみます。

回答No.2

teru-arai

AMPで出ているなら、コンピーテントセルと技術に問題はないと思います。
１）うまくいきすぎて大腸菌が生えすぎているか、２）クロラムフェニコールが古くて分解しているのに気がついてないかのどちらかに見えます。
あと、少しひっかかるのはAMPの時との操作の違いです。AMPの時はプラスミドをコンピーテントセルに混ぜてから、液体培地37℃インキュベートせずに、いきなりお皿にぬれますが、クロラムフェニコールの場合は1時間くらいのインキュベートが必要です。インキュベートしてますよね？　ただ、インキュベート無しだとクロフェニの場合うまく生えないと思いますが、 その場合には“細かいコロニーが大量に生え”とはならない気がしますので、この操作の差は関係ないとは思います。上の1か2だと思います。

お礼

ご回答、どうもありがとうございます。トランスフォーメーション時に、３７℃で１時間インキュベートしています。また、コンピテントセルをSOC培地で１／１０００に薄めてプレートに蒔いても大量にコロニーが生えてきたので、２）の可能性が高い気がします。新しくクロラムフェニコールを買うことを考えてみます。ちなみに、クロラムフェニコールプレートを作成した場合、どのくらいの期間4℃に保存しておくことが可能なのでしょうか。

回答No.1

geneticist12

XL10-GoldはF'の上にテトラサイクリン耐性(Tet^r)とカナマイシン耐性 (Cam^r)の遺伝子が乗っていましょう？　つまりベクターが入らなくてもカナマイシン耐性です。遺伝子型を確認してみてください（基本中の基本）。
XL1-BlueやDH5でいいんじゃないでしょうか。
IPTGはlacプロモータを活性化するためで、プレーティングするときに入れるのはlacZを発現させてBlue/whiteセレクションするためです。pOTB7はBlue/whiteセレクションできるベクターではなかったのでは？　ならばIPTGは不要です。

お礼

どうもありがとうございます。コンピテントセルによって耐性が異なるんですね。大変勉強になりました。しかし遺伝子型を確認して見たところ、Tet^rのみのようです。ということはXL10-Goldも使えるはずということでしょうか。