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クロラムフェニコールで選別するトランスフォーメーション
- クロラムフェニコールプレートにトランスフォーメーションを行ったが、細かいコロニーが大量に生えてしまう
- クロラムフェニコールで選別する際にはIPTGの塗布が必要か
- 使用するベクターによって使用可能なコンピテントセルが異なる
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- Dr_Hyper
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ちゃんとお使いの株のことを調べてませんが、クロラムフェニコール耐性株をつかっているのでplasmidが入ろうがはいらまいが大腸菌が生えてきてしまっているように思います。または、Goldを使っているため効率が良すぎて生えすぎている（plasteの上に大腸菌が増えているのではなくて、うっすら撒かれた大腸菌の上に、さらに大腸菌が生息している状態）可能性もないとは言えません。 遺伝型を調べるのがめんどうであれば、ベクターを入れずに同様の処理したcompetent cellを撒いてみて確認してください。何も生えてこなければ使えるということですよね。 蛇足ですが学生が自前でcompetent cellを作製するときなど、このような確かめ実験をしてplasmidがコンタミしていないことを、またはcompetent cellが薬剤耐性になっていないかどうかを確認するのに使います。
お礼
ご回答ありがとうございます。遺伝型を調べてみたら、クロラムフェニコール耐性でした。新たにコンピテントセルを購入してやってみます。 また、ベクターを入れないコントロールも行ってみます。
- teru-arai
- ベストアンサー率74% (40/54)
AMPで出ているなら、コンピーテントセルと技術に問題はないと思います。 １）うまくいきすぎて大腸菌が生えすぎているか、２）クロラムフェニコールが古くて分解しているのに気がついてないかのどちらかに見えます。 あと、少しひっかかるのはAMPの時との操作の違いです。AMPの時はプラスミドをコンピーテントセルに混ぜてから、液体培地37℃インキュベートせずに、いきなりお皿にぬれますが、クロラムフェニコールの場合は1時間くらいのインキュベートが必要です。インキュベートしてますよね？ ただ、インキュベート無しだとクロフェニの場合うまく生えないと思いますが、 その場合には“細かいコロニーが大量に生え”とはならない気がしますので、この操作の差は関係ないとは思います。上の1か2だと思います。
お礼
ご回答、どうもありがとうございます。トランスフォーメーション時に、３７℃で１時間インキュベートしています。また、コンピテントセルをSOC培地で１／１０００に薄めてプレートに蒔いても大量にコロニーが生えてきたので、２）の可能性が高い気がします。新しくクロラムフェニコールを買うことを考えてみます。ちなみに、クロラムフェニコールプレートを作成した場合、どのくらいの期間4℃に保存しておくことが可能なのでしょうか。
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
XL10-GoldはF'の上にテトラサイクリン耐性(Tet^r)とカナマイシン耐性 (Cam^r)の遺伝子が乗っていましょう？ つまりベクターが入らなくてもカナマイシン耐性です。遺伝子型を確認してみてください（基本中の基本）。 XL1-BlueやDH5でいいんじゃないでしょうか。 IPTGはlacプロモータを活性化するためで、プレーティングするときに入れるのはlacZを発現させてBlue/whiteセレクションするためです。pOTB7はBlue/whiteセレクションできるベクターではなかったのでは？ ならばIPTGは不要です。
お礼
どうもありがとうございます。コンピテントセルによって耐性が異なるんですね。大変勉強になりました。しかし遺伝子型を確認して見たところ、Tet^rのみのようです。ということはXL10-Goldも使えるはずということでしょうか。
お礼
すいません。ただのXL10-Goldのことでした。 遺伝子型の読み方を勉強します。では、XL10-Gold Kan^rを新たに購入して使用してみます。とても助かりました。どうもありがとうございます。