培地交換時の細胞の剥離について

質問

ある種の繊維芽細胞を24穴プレートに播種しました。ところが翌日に培地を交換した直後に顕微鏡で確認したところ、細胞内に粒状のものが多くみられ、しばらくすると剥がれて死んでしまいました。これまでに同様の条件で6穴や96穴プレートに播種しましたが、このようなことはありませんでした。
この現象は何が原因なのでしょうか。また、解決する方法がありましたら、アドバイスをいただきたいです。
よろしくお願いします。

回答No.2

MIYD · ベストアンサー

異なる培地でも再現性があると言うことは、
培地ではなくてプレートやハンドリングの問題ではないでしょうか。

気になるのはP1000と2mlピペットの違いですが、
ブルーチップは自分で詰めているのでしょうか。
よほどのことが無ければ、変なものは溶出されてこないと思いますが、
念のため、ブルーチップで6穴プレートに培地を入れてみてはいかがでしょうか。

お礼

ブルーチップは自分でつめていますが、6穴プレートで
P1000を使って培地交換をしても細胞に異変はありませんでした。
やはりハンドリングの問題でしょうか。
丁寧なアドバイスありがとうございました。

回答No.1

MIYD

24穴プレートは細胞培養用のものでしょうか。
細胞内にある粒は、培地交換の前にはないのでしょうか。
しばらくというのはどのくらいの時間でしょうか。
培地は液体でボトリングされているものでしょうか。それとも、粉から溶かして作っているのでしょうか。
使った培地やプレートで再現性はあるのでしょうか。

再現性が無いのであれば、解決することは出来ないと思いますが。
問題になる可能性が高いのは、トリプシン処理、培地、プレートの順だと思います。

まずは、トリプシン処理した同じサンプルを、問題の２４穴プレートと別のプレートに撒いて見てはいかがでしょうか。
24穴プレートに撒いた細胞だけが張り付かないのでしたら、プレートに問題がある可能性が高いです。
細胞培養用のディッシュなのに、処理がされていなくて、張り付かないディッシュを見たことがあります。
両方とも張り付く、または張り付かない場合は、YUKA82さんの操作に問題があるか、培地に問題があるかと思います。

同じ培地を張り付いている他のプレートにかけてみてはいかがでしょうか。
トリプシンが培地にコンタミしても、あまり細胞の接着に影響は少ないですが、EDTAがコンタミしていると剥がれる可能性があります。
PBSに間違えてEDTAを入れると、写真撮影中に浮いてきます。

お礼

24穴プレートは細胞培養用のものを使用しています。
細胞内にある粒は培地交換前にはなく、交換直後にみられ、数分すると細胞が死滅していきます。細胞膜も破壊されてしまうため、張り付いていないのではなく、死んでしまっているものだと思います。
6穴プレートや10cm dishではこのような現象はおこりませんでした。また、他の種類の細胞でやっても(培地の種類も異なります)同じことが起こったので、やはり培地交換が原因ではないかと思われます。
ただ、交換時にアスピレーターで培地を吸引し、1000ギルで培地を補充していましたが、デカントで培地を捨て、2mLの電動ピペッターで補充する方法に変えたところ、細胞は無事でした。
細胞に対する衝撃が原因だったのでしょうか。