ウエスタンでのトランスファーがうまく出来ない

質問

はじめまして。
現在、ウエスタンブロットを行っているのですが、転写時に、どうしても転写出来ていない部分（泡よりも広範囲の水滴が落ちたようなもの）が出てしまいます。（転写はWET式、条件は、180mAの定電流で、目的のタンパクは40～70kDのものです）
ろ紙の枚数を増やしましたが、うまく転写出来ません。
よろしくお願いします。

回答No.2

tonyto · ベストアンサー

トランスファーを行うとき、
ろし、メンブレン、ゲル、ろし　を空気が入らないよう丁寧に置いていますか？
特にメンブレンとゲルの間に気泡が入ってしまいますと、その部分だけ転写されず、発色時に細かい水たまりのようなものができてしまいます。

参考までに、ATTOの実験のコツのページをリンクしておきます。

参考URL：

http://www.atto.co.jp/kotsu_series.html

お礼

お礼が遅れて申し訳ありません。
ATTOは、とても参考になりました。
とりあえず、ウエスタンのブロッティングを行っている、多孔性のフィルターが古くなっているのが原因の一つだと考えられので、新しいフィルターでやってみます。
ありがとうございました。

回答No.1

MIYD

メンブレンをポンソーSなどで染めて見たのでしょうか。
それとも、WBでフィルムにやいたときの結果でしょうか。
それによって、問題が転写時なのか、抗体反応時なのかがわかると思います。

泡が入っているであれば、とりあえずそこは改善すべきではないでしょうか

メンブレンをメタノールにつける時(必要ならば)に十分に浸かっていますか

補足

返信ありがとうございます。
PVDFをフィルムに感光したした後、アミドブラックで染色した際に、うまく転写出来ていない部分があります。おそらくは、転写時に生じたものだと思います。
また、ゲルをCBBで染色した際にも、PVDFで水滴が生じる部分と同じような場所で、バンドがぼやけています。
PVDFを十分にメタノールに浸してみます。