配列が読めません！！！

質問

今、DNAの塩基配列を読もうと試みているのですが、
全く読めません。
今回よみたいにはコスミドで約40kbほどあります。
系は、12μlに、コスミドDNA200ng/mlと、
プライマーが3.5pmolが入っています。
プライマーはＴ3とＴ7です。
これが読めないと先に進めない為、困っています。
一応、DNA量を数倍にしてやってみたりもしたのですが
うまくいきませんでした。
何かいい方法があったら教えてください！！

回答No.4

joyjoyjo

シークエンスreactionに用いているキットの種類はなんでしょうか？
もし、ABIのBigDye terminator v3.1 cycle sequencing kitであれば、プロトコールにコスミドをテンプレートにした時のやり方が載っています。
それによると、コスミドテンプレート量が500-1000 ngと必要みたいですし、PCRサイクルも50回にすることも書いてあり、通常のシークエンスreactionと異なってます。
一度お使いのkitのプロトコールをお読みになって（もう読んでると思いますが）、その通りに行い、それでも駄目なら、メーカーに直接問い合わせることをお勧めします。
プロトコールにコスミドをテンプレートとした時のやり方が載ってなかった場合も、メーカーに問い合わせてやり方を聞いてみた方がいいと思います。

あとABI PRISM 377XL DNA Sequencerってゲル板でしたっけ？
もしそうで、ゲル作りをご自分でなさってるのでしたら、そのゲルでちゃんと読めることも確認した方がいいかもしれません。

回答No.3

MIYD

使っているキットによるのでまったく見当違いの事を欠いているかもしれませんが

12ulの系でコスミドDNA200ng
(/mlでなくて200ngですよね？
2.4ng/vialではないですよね？)
は通常のサイズのベクターでの系ではないでしょうか。
モル数を合わせるのならば10倍くらい入れないといけないのではないでしょうか。

回答No.2

noname#17364

こんにちは。

問題があきらかにこのサンプルに特異的なものなら、やはりプライマーを変えてみる、ラベリングの際の温度設定を変えてみるとかの必要があるかもしれませんね。

あとは外注のサービスに出してみるか、でしょうか。ニッポンジーンのCUGAっていうシークエンシングサービスは、難読配列が読める！っていうやつです。もちろん、こればっかりは当たるも八卦、ですが。

参考URL：

http://www.nippongene.com/pages/products/seq/css/

回答No.1

MIYD

使っているベクターとシーケンサーがわからないので参考になるかわかりませんが

サーマルサイクラーのプログラムが書き換えられていたために読めなかったことがあります。
シーケンス用の反応はうまくいっているというコントロールはあるのでしょうか。

pBSベクターでT3で読めないサンプルがM30reverseで読めたことがあります。
M13等の他のユニバーサルプライマーや
コスミド内にあると考えられる配列のプライマーは使えないのでしょうか。

16連のキャピラリーシーケンサー用のサンプルで読めなかったものを1連のキャピラリーシーケンサーで流したら読めたことがあります。

適当な制限酵素で切ってサブクローニングして読んでみてはいかがでしょうか。

お礼

回答ありがとうございます。
私が使っているベクターは、SupreCos cosmid vecter
というもので、使用しているシーケンサーは
ABI PRISM 377XL DNA Sequencerです。
サーマルのプログラム書き換えもなく、シーケンス用の反応もうまくいっています。
かれこれ４，５回、DNA量を変えてやってみて、
まだ成功していません・・・。