細胞小器官の遠心分画法について

質問

いつもお世話になっています。

ブタの肝臓をハサミで細切した後、テフロン・ホモジナイザーにかけてホモジネートを作製、遠心して核・ミトコンドリア・リソソームなどに分画しています。
それぞれの画分の純度はマーカー酵素活性の測定と電子顕微鏡による観察でチェックしています。
しかし、酵素活性でも電子顕微鏡でも、どうやらきちんと分画できてないらしいことがわかりました。
精製にするにつれて高くなってほしい比活性が低下したり・・・
電顕でもミトコンドリアなどはマトリックスの構造がちゃんとしてなくて、「ほんとにミトコンドリア？」ってくらいです。
大きさとしては2μmくらいの小胞が並んでいるのでミトコンドリア（の残骸）なんだろうと推測するしかない感じです。

一つには臓器を一度-80℃で凍結して保存し、それを融解して使っていることが問題なんだろうかとも思いますが、こんなにめちゃくちゃに壊れてしまうほど、影響のあるものなんでしょうか。

調製用のバッファーには等張の0.25Mスクロース、5mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、pH7.4を用いています。
テフロン・ホモジナイザーも本にあるとおり、水を入れて手を離すと静かに落ちてくるくらいのクリアランスのものを使っています。
回転数は600rpm、2往復しています。（1往復でも試しましたが駄目）
あとは遠心するだけなので問題ないと思います。

これはやはり臓器の凍結の問題なのでしょうか？
あるいはホモジナイザーのクリアランスをもっとゆるくするべきなんでしょうか？
どなたかご教示お願いいたします。

回答No.1

dadachan · ベストアンサー

ブタの肝臓を使用させる場合、結合組織等が邪魔をするためにガーゼなどのメッシュで一度細胞だけにしてからホモジネートします。
凍結融解は、それだけで細胞が壊れますが細胞内のオルガネラにはそれほど影響を与えないと思いますが・・・
凍結がゆっくりであったりすると確かに影響はありますので、凍結方法を検討する、あるいは新鮮なものを得るなど工夫されてはいかがでしょうか？

お礼

回答ありがとうございます！
ガーゼは孔のサイズなど指定があるんでしょうか？
よろしければご教授ください。
ガーゼを通すというのは、粗ホモジネートの時に通すということですよね？

回答No.2

dadachan

ガーゼは普通のガーゼを数枚重ねるだけで十分ですよ。
ごくごく普通の、薬局で売っているようなやつです。
それでもダメなら、また書き込みしてくださいね。

お礼

ありがとうございました！
だいぶましになってきました。
もうちょっと頑張ってみます。
また分からなかったらよろしくお願いします。