ブロッキングって必要なのでしょうか？

質問

蛍光染色法で2次抗体の非特異性を抑えるために、2次抗体と同種の動物の血清でブロッキングしなさいとよく書いてあるのですが、例えば2次抗体がヒトの血清タンパクで吸収済みのものを使用するときに、ヒトのタンパク質を調べる上ではブロッキングしなくてもよいように思うのですが、どうなのでしょうか？
やはりバックグラウンドは高くなってしまうのでしょうか？

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

抗体を吸収処理するのと、ブロッキングは狙っているところがちょっと違います。

たとえば抗マウスIgGの二次抗体を、ラビット血清タンパク質で吸収してあれば、ラビット由来の一次抗体に交差反応するのを防ぐことができます。一次抗体でマウス由来のものとラビット由来のものをつかって、別々の抗原を検出できるようになります。

組織標本にせよウェスタンブロットにせよ、抗体に限らず、いかなるタンパク質でも多かれ少なかれ吸着します。あらかじめ適当なタンパク質を吸着させることによって、抗体が非特異的に吸着されるのを押さえるのがブロッキングです（この点に関しては、BSA、カゼイン、ヘパリン、各種血清、どれでも狙いは一緒です）。

特に組織標本の場合、タンパク質のなかでも特に抗体が非特異的に吸着しやすい性質があるかもしれません（たとえば、プロテインA/Gとか補体のようなタンパク質が存在するかもしれません）。また、それぞれの種の抗体が、内在的にもっている交差反応性があるかもしれません。そのためには血清、とくに後者の理由から、同種の血清でブロッキングするのがよいとされています。

ただ、私の経験では、どうしても「同種の」血清でなければよくないというようなことはありませんでした。
また、非特異的吸着や交差反応は、抗体ごと、サンプルの種類ごとに違うので、ブロッキングの必要性もまちまちです。ものによっては、全くブロッキングなしでもきれいに染まるものもあります。

お礼

なるほど・・・すごくよくわかりました。
一度いろんな血清で吸収処理されているものを使用してみたところブロッキングしなくてもきれいに染まったものですから、もしやと思ったのですが・・・
それとできるだけ工程をサボりたかったものですから・・・
がんばります。ありがとうございました。

回答No.2

geneticist12

＃１です。ちょっとだけ補足

バックグラウンドを押さえるために、前吸収することはありますが、血清に対してではなく、染色する組織と同じものでやります。

二次抗体の由来と同種の血清でブロッキングする理由でもっと大事なのは、血清中の免疫グロブリンにたいして最も交叉反応しにくいということでしょう。抗マウスIg抗体が、ブロッキングに使ったヤギ血清と交叉反応する可能性もないわけじゃないですから。