無細胞条件と細胞条件培地について

質問

ある受容体と、あるタンパク質(単量体、二量体、三量体)の結合性を見ている実験があります。
無細胞条件では単量体が結合し、細胞条件培地では二量体と三量体の結合が見られ、この結果から
あるタンパク質の二量体と三量体はある受容体の細胞外領域と相互作用を起こしているということを証明したと書かれた論文がありました。
どうしてこのような結果と言えるのでしょうか？
分かる方よろしくお願いします！

回答No.2

noname#143207 · ベストアンサー

こんばんは、ペーパーをお送りいただきまして、どうもありがとうございました。

Figure S2. Interaction of Aβ oligomers with EphB2.

（１）無細胞実験（アビヂン結合ビーズを用いたWB検討）
a: WB (anti- Aβ)での結果： AβオリゴマーとEphB2とのbindiongが確認された。また1μgで十分であった。
b: WB (anti- EphB2)での結果： AβオリゴマーとEphB2とのbindingが確認された。

→　aの濃度の低いところを見ていただければ分かりやすいと思われますが、本無細胞実験では、mono-, di- and tri-mer全てにおいてEphB2と結合していることが確認できます。

（２）以下も無細胞実験（各抗体にてIPしたときのWB検討）
c: anti- EphB2でIPしたタンパクをanti- Aβを用いてWBにて解析：AβオリゴマーとFc-EphB2は結合していることが示唆された。（なお、Ctはnegative control）
d: anti- AβにてIPしたタンパクをWB（anti-EphB2）にて解析：AβオリゴマーとFc-EphB2は結合していることが再度、示唆された。（Ctはnegative control）

→　確かに、Aβとの結合が認められますが、これだけからは、mono-, di- and/or tri-merのどれなのかの判断は困難かと考えられます。ですが、aの実験から、全てのオリゴマーとEphB2とが結合すると考えてよろしいかと思われます。

（３）今度は細胞培養実験
e: 7 DIV細胞を予めビオチン標識Aβオリゴマー（mono-, di- and tri-mer）で処理したものを、anti-EphB2にてIPさせた。その後anti-AβにてWB解析： trimerのみとの結合が見られた（trimerのバンドしか確認不可能）。monomerおよびdimerとの結合は見られない！
g: 7PA2-conditioned medium (7PA2) or untransfected CHO cell-conditioned medium (Veh)をanti-EphB2にてIPさせた。その後anti-AβにてWB解析：dimerとtrimerとの結合が見られた（dimerとtrimerのバンドしか確認不可能）。monomerとのbindingは見られない！

→　eにおいては、trimerのみと、そして、gについては、dimer、trimerとのEphB2結合が見られただけでした。

> 無細胞条件では単量体が結合し、細胞条件培地では二量体と三量体の結合が見られ、この結果から

　厳密には、無細胞条件では単量体、二量体、三量体、全てのオリゴマーとの結合が見られる。と考えられます。
　また、細胞培地では、単量体はいずれの条件下においても確認できないが、培地条件によっては、二量体、三量体との結合は見られる。と考えられます。

> あるタンパク質の二量体と三量体はある受容体の細胞外領域と相互作用を起こしているということを証明した

　上述より、二量体と三量体はEphB2受容体との結合（＝相互作用）が確認されました。また、Aβオリゴマーのような高分子は通常、細胞内に入り込むことは不可能ですし、また実験手法から、細胞外としか考えられない。と察せられます。

　また何かございましたら、ご返信くださいませ。

　ご参考になれば、幸いでございます。

お礼

こんなに詳しく教えていただきましてありがとうございました！！
実は、明日この論文の内容を説明するというプレゼンがありまして、とても助かりました！
ありがとうございます。

回答No.1

noname#143207

こんばんは、

　申し訳ないのですが、補足要求をさせていただきたく存じます。

・二量体、三量体とは、それぞれホモダイマー、ホモトリマー　と解してよろしいのでしょうか？

・無細胞条件では単量体が結合するが、二量体、三量体は結合しない。ということでしょうか？

・細胞条件培地では二量体と三量体の結合が見られるが、単量体では結合が見られない　ということでしょうか？

　もし、よろしければ、ペーパーを紹介していただけますでしょうか？ 　もしくは、
PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/advanced　でも結構ですので、abstrastが読めるものはございますでしょうか？

　当方、大抵のものは入手可能ですので、一読し、ご返答したいと考えております。

　それでは、よろしくお願いします。

補足

Natureの「Reversing EphB2 depletion rescues cognitive functions in Alzheimer model　/ EphB2枯渇の解消はアルツハイマー病モデルにおける認知機能を改善する」という論文です。
ちなみにこの実験は論文に付属しているSUPPLEMENTARY INFORMATIONのFig.2に載っています。
掲載ページはhttp://www.nature.com/nature/journal/v469/n7328/full/nature09635.htmlです。
よろしくお願いします！