RNA(DNA) competitorの作製に関して

質問

今回の実験でcompetitive PCRを使ってmRNAを定量したいと思っています。しかしこの実験で一番重要なcompetitor RNA(DNA)を作るときの注意点がいまいち分かりません。
　お手数ですが、どうか教えてください。

回答No.3

robita · ベストアンサー

プライマーが

Sense Primer:5'-Sp6 promoter-Target PrimerFor-Template PrimerFor
Antisense Primer:5'-Target PrimerRev-Template PrimerRev

となっていると思いますが、基本的にはTemplate PrimerのTm値付近にアニ－リング温度を設定すれば十分です。5'側に付加配列をつけてのPCRはよく行われることです。TaKaRaのCompetitor作成プロトコルではアニ－リング温度を60度としているのでまずはマニュアルにしたがってみて下さい。

ただ、今回のprimerは全体が45-60merとなっているので増やしにくいと予想されます。カラム精製の前に増幅産物の一部を取って電気泳動で確認して下さい。もし、増幅が確認できなかったり、増幅産物の長さがおかしいようであればPCRの条件を振る必要があると思います。

>一般的にプライマーの長さはどれくらいがよいのでしょうか？

これはtarget primerの長さですか?一般には18-30merほど、できれば21-28mer程度が良いです。ただ、PCR（特にRT-PCRの場合）は増幅効率が良いprimerを用いることが大前提です。前回の回答に記入した通り、target primerに関しては予備実験を行うことをお勧めします。また、論文のマテメソにあるprimerを参考にしても増えないことがしばしばありますので注意してください。

お礼

本当にありがとうございました。それと自分のパソコンではないのですぐにお礼ができなくてすみませんでした。

回答No.2

robita

Competitive PCRに関してはTaKaRa Bioのオンラインカタログには詳しく載っておりますね。

ただ、キットを使用しなくてもTemplate DNAをLambda DNAで代用するなりすれば、Competitorは簡単に自作できますよ。

TaKaRa社のプロトコルでは逆転写反応にRandom Primerを用いていますが、競合PCR時にはRandom Primerは良くないと書かれたプロトコル集もあるので注意をして下さい。それとキットではPCR産物を直接Sp6 polymeraseを用いてRNA competitorを作成していますが、後々の汎用性を考えるとpBluescriptなりのベクターに組み込んだほうが良いと思います。

もし、自分がこの実験系を計画するならば
LinkerA-Primer1-LinkerB-Primer2-LinkerCなるcompetitorに対して(LinkerBはhetero-duplexを防ぐためにtargetと異なる配列を用いる場合)、Lambda DNAの一部をLinkerBに用いるため、[Target PrimerFor-Lambda DNA specific PrimerFor]、[Target PrimerRev-Lambda DNA specific PrimerRev]というprimerを用いてPCRをした産物をpBluescript (2)なり（この場合は制限酵素サイトを付加しておくと良い）、pGEM-T(-Easy)なりに組み込み、シークエンスを確認後、LinkerCとなる部分にPoly AまたはTargetの3'配列を組み込んで「Competitorのもと」としますがどうでしょうか?

さらに補正目的でhousekeeping遺伝子と競合できるようにしておくと良いですね。（LinkerA-PrimerFor1-PrimerFor2-LinkerB-PrimerRev2-PrimerRev1-LinkerCとなるようにする。この場合LinkerC部分はpoly Aを入れる。）

説明が長くなって申し訳ありません。

>実験としてはtotal RNAの抽出までしか行ってません、なのでこれから先のことは実験したことがないです。

まず、最初の実験はTarget遺伝子を「効率よく」増幅できるプライマーを探すことからでしょうか？慣れればそれほど大変な操作ではありませんので、実験を頑張ってください。

分からないことがありましたら補足欄に書き込んでください。時間に余裕があるときにレスします。

補足

とても丁寧に回答していただきありがとうございます。このTAKARAのキット（テンプレートDNA＝λDNA）でRNA competitorを作製しようと思っているのですが、これの説明書を参考にしてデザインすると、センス，アンチセンスプライマーの長さがかなり異なったものになってしまいます。このような場合、どちらのTm値に合わしたほうがPCRがうまくいくのでしょうか？それと一般的にプライマーの長さはどれくらいがよいのでしょうか？お手数ですが宜しくお願いします。

回答No.1

robita

hiro560127さん、こんにちは。
以前、マウスプロラクチン受容体の競合PCRをしたいといっていた件でしょうか？
回答前に少し、アドバイスと補足要求をさせてください。

以前の質問に対し、回答者の皆さんが競合PCRによる定量を反対されていましたが、競合PCRによる定量はその「利点」を理解して使用しなければ、「労多くして益少なし」な実験です。hiro560127さんが計画を立てている実験で、もし、その他の手段で定量可能であれば、そちらをお勧めします。（以上がアドバイスです。）

補足要求ですが、
１．hiro560127さんは、どれだけ分子生物学の実験を熟知していて経験がありますか？
２．実験は予備実験を含めてどこまですすんでいて、どこまでの回答がほしいのですか？
３．身近に今回の実験や分子生物学一般についてアドバイスをもらえるヒトがいますか？

詳しく補足をお願い致します。補足を頂かないとどこまで注意点を説明してよいか分からないのです。

お礼

返事が遅れてすみません。
正直に言えば分子生物学の実験は今までに行ったことはありません（研究室内でも）。それとたまたまプロラクチンの定量に関しての参考文献がこの方法でやっていたからこの方法でやることにしました。それで様々な参考書を読んで自分なりにそれらを組み合わせて計画を立てました。最近になってTAKARA社のDNA competitor作製キットを用いて作る方向で話を進めています。実験としてはtotal RNAの抽出までしか行ってません、なのでこれから先のことは実験したことがないです。
　こんな感じなのでこの方法以外の実験は詳しくは知りません。
　robitaさんには本当に感謝しています。こんな事しかかけなくて本当にすみません。