教えてください！血球計算盤の使い方

質問

血球計算盤で培養細胞を数えられません！
ピントのあわせかたによって、培地に混じったゴミが
半透明にそれっぽくみえたり、もやっと大きく見えたりしますよ・・ね？
あれと細胞の区別がつかないんです・・・。

血液細胞なら大丈夫でした。
が、培養細胞だと、これゴミ？？細胞がクシャッとしたやつ？？と
どうしても自信がもてません。
教えてもらったり、人が数えた結果から推測してみるのですが、
それでも自信をもってカウントできず・・・。
（ちなみに人が数えた結果とは明らかに違う数値が出ることがあります）
なんで、こんなことでつまずくんだ～？？って感じです。

血球計算盤に細胞がのってる画像（視野中に何個細胞がみえてるのか書いてあるもの）
ってどこかにないでしょうか～？？もし知ってましたら教えてください。
wikiはみました。（20区画に35個くらい・・でいいんですよね？）

回答No.5

noname#246097 · ベストアンサー

こんにちは、以前血球計算盤で培養珪藻のカウントをしたことがあるので少々思い出して・・・。
そうですね、通常の血球計算盤は1ｍｍ＾２を20×20のマスに区切り、カバーグラスを乗せることで0.1ｍｍの高さ（深さ）に資料が乗るようになっていますね。この0.1ｍｍの深さが問題でありまして、私の場合は5ミクロン前後の細胞をカウントしていました。資料をセットした時には0.1ミクロンの深さの浅い部分にも深い部分にも細胞は存在していて、決まったピンと部分ですべての細胞がはっきり見えることはあり得ないことでした。そのため細胞がそれを含む周囲の液体等より比重が重ければ、資料を血球計算盤にセット後5～10分程度静置していました。そのうち細胞が0.1ｍｍの下部に沈みピントがあってきて計数しやすくなったのを思い出しました。当然ですがその段階で目的の細胞とそれ以外の物の区別もつきました。頑張ってください。

お礼

はああ、なるほど。
そういった物理的な要素も関係するんですね。
確かに0.1ｍｍというのは細胞の大きさからするとでかいように思えますね。今度みたときに、細胞にピントがあっていないせいなのか、それ以外の原因でつまずいているのか確かめてみたいと思います。

なにより、簡単な所でつまずいてしまってちょっと自信喪失していたのですが、視野一面に広がるキレイな珪藻・・・というのを想像してなんとなく元気が出ました。（そういうものとは全然縁のない分野にいるので(^^;)
回答ありがとうございました！

回答No.4

otx

っていうか、実際に他の人に見てもらうとか
他の人ではどうなっているのか見た方が早いと思います。

お礼

あ、そうなんです。
実は先日、他の人にみてもらってどうなっているのか聞きつつ
カウントしたのですが、よくわからなかったので質問させてもらったのです。
教えてもらった人とピントの合い方が違うのか、顕微鏡のピント調節ねじが緩んでいるのかで、ごたごたしてるうちに時間切れで。

それで、実際に計算盤に細胞がのっている画像と、解説的なもの（細胞数は何個です、のような）があれば、わかるんではないかな
と思ったのです。（^^;）

回答No.3

Dr_Hyper

培養細胞は何を使用しているのでしょうか？
付着細胞をカウントしようとしているのかなと想像します。
細胞をはがすときにトリプシンなどを用いてはがして懸濁してから算定されていますか？通常付着細胞でもトリプシン処理などを行い培養液に懸濁すればほぼ球形になってくれますので血球細胞がカウントできたのであれば問題なく出来ると思います。一方スクレイパーで掻き取ったり十分トリプシンなどの酵素を聞かさないでピペティングではがしたりすると、細胞の扁平な形状を維持した状態になり形がまちまちになったりすることはあり得ます。
また培養液に血清成分由来の脂質などのかたまりがありゴミのように見える場合には一部だけでも良いのでフィルターを通してキレイにしてから、その培養液を用いて細胞を懸濁しカウントすればゴミじゃないかという懸念はぬぐえると思います。
ちなみにピントは普通碁盤の目がキレイに見えるとところにあわせるのが普通でそれ以外でカウントする意味はありません。この層の幅は0.1mm程度なのでいろいろとピントが合うのはおかしいのですがね。

補足

カウントした細胞はES細胞です。
トリプシン処理＆凍結保存→解凍したものを培養液でうすめて顕鏡
しました。
前からカウントに苦手意識はあったのですが、ESの時は何故か丸い影が大量にみえ、すっかり混乱しました。
碁盤の目がきれいにみえるところがピントとして
正しいということですので、
冷静になってもう一度試してみようと思います。
フィルターについても、改善しなかった場合検討してみたいと
思います。

回答ありがとうございました！！

回答No.2

otx

そもそも、ピントの合わせ方によって見え方が変わるのがおかしいと思います。
ニュートンリングができるようにガラス板をセットするということをご存知でしょうか？
http://rinsh.blog118.fc2.com/blog-entry-6.html

今はそうなるように金具が付いた計算盤もあります。
http://www.soran.net/index_html/A0070013.htm

ガラス板と計算盤の隙間は0.1mmまたは0.2mm程度になるはずです。
そのとき、細胞を見るのに充分な倍率であったら、同じピントの視野で細胞はすべて収まります。

細胞と見分けがつかないゴミとありますが、それがもし死細胞由来だったら、トリパンブルーを使えば死んだ細胞は青くなるので生きた細胞と見分けは簡単です。
http://sirius.chem-eng.kyushu-u.ac.jp/manual/トリパンブルー染色.txt

それ以外のゴミは細胞と簡単に見分けられると思いますが。。。

お礼

詳しい説明がなくてすみません。
器具は、金具付きのものを使っています。

同じピントの視野ですべておさまるんですね。
ありがとうございます！参考にさせていただきます。
カウント中ピントをぐりぐり変える必要はないということですね。
染色という方法もあるんですね。
ほかの人は、普通に数えられるよ？といっていたので
役立つかわかりませんが、ひとつ知識が増えました。

次回カウントする時に、まあいろいろとがんばってみようと思います。

回答No.1

de_tteiu

確かに、ゴミとか（血清などの）が付く時もありますがそんなに迷いますかね　むしろそのような状況で培養していて大丈夫なのでしょうか…

不安なら判別できる場所のみで数えればいいかと思います、またなるべく多くの場所で数えて平均化するのもいいかと

一応見つけました
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100002690

お礼

う～ん、そうなんですよね。
「そんなに迷いますかね」っていうのは
ほんっとうにその通りです～(;;)
ただ、普通は数えられるものであるようなので、（人の数えるのをみるかぎり）ゴミが多すぎるというより、私の見方がなんかおかしいんではないかと・・・。

平均化というのは一案ですね。
しかし、平均化しても間違うことがあるんですねこれがー！
あ、画像みさせていただきました。ありがとうございます。