ｈｐｌｃ移動相の相談

質問

ラッカーゼ（ph安定性５～９）でポリマー（ph７～）の分解試験をしたいのですが，HPLC分析での適当な移動相がわかりません．弱アルカリで反応させた試料を酸性調製し，ラッカーゼを失活させても，移動相が弱アルカリ性ならば失活効果はないのでしょうか．ヒドロキシル基のあるポリマー充填カラムで分析するので，酸化作用のあるラッカーゼをカラムに通すのが不安です．また，分解したいポリマーは弱アルカリでないとラクトン型となり析出してしまいます．
何か良い案はないでしょうか．宜しくお願いいたします．

回答No.2

c80s3xxx

NaN3 はともかく，システインはふつうのアミノ酸ですし，どうってこともないような気がしますが．

GPC カラムでそのままでいいのでは，というのは，分解対象のポリマーと酵素がカラム中で分離されるからです．そうでなくてはそもそも GPC で分解パターンを見ることもできないわけですし．分離が不十分な間はある程度反応するかもしれませんが，反応時間に対して誤差程度の影響ですむように条件設定できるのではないかと思います．熱失活はだめでも，温度を下げ (分解能は落ちるがやむを得ない) 分解速度を少し落としておくことを併用するという手もあるでしょう．

ラッカーゼについては詳しくありませんが，フェノール性の OH が基質だったと思うので，PVA 系のカラムに対する影響は低いと思います．心配であれば，酸化剤がなければ反応もおこらないので，溶離液をデガッサ等で溶存酸素濃度を十分に下げるのも有効でしょう．

お礼

c80s3xxx様
ご回答有難うございました．
くださった助言を参考にさせていただき，カラムの製造元の方にも分析法を伺ってみます．

親切に答えてくださって誠にありがとうございました．

回答No.1

c80s3xxx

分析を GPC でやるなら，反応停止とか考えずに，そのままカラムに打ち込んでしまっていいような気がしますが．溶離液も，酵素活性の問題以外がないなら，反応液と同じでいいような．
ちょっとカラム温度を高めておいて，酵素活性を落とすという手もあるでしょう．HPLC の分解能的にもそのほうが有利ですし．
あるいは，反応停止のため，NaN3 とかシステインや DTT みたいな阻害剤を入れてから分析するとか．阻害剤によっては溶離液に入れておいてもいいかも．

補足

c80s3xxx様
ご回答有難うございました．
阻害剤は毒物ですし，難しい方法です．
また，使用する酵素は70℃まで耐熱性で，しかもカラムの使用温度の上限が70℃と，温度による失活という方法も利用できないのではと思います・・・．
質問なのですが，
なぜGPCカラムでは酵素の反応停止を考慮する必要がないのですか．
また，使用するGPCカラムはポリビニルアルコールが充填してあります．ヒドロキシル基が，活性化している酵素によって酸化されることはないのでしょうか．
知識不足で申し訳ありません．
宜しくお願いいたします．