リアルタイムPCR用プライマーの設計

質問

Roche社のライトサイクラーを用いてリアルタイムPCRを行う予定なのですが、増幅サイズをどのくらいに設定してプライマーを組めばよいのでしょうか？

タカラバイオ社のマニュアルでは80～150bpと書いてありますが、400bpくらいで行っている人もいます。

機種によって異なるのでしょうか？

回答No.1

lamb1204

同じくRocheのライトサイクラーを使っています。
酵素はTaKaRaのものもRocheのものも使っています。
通常の系で行なうのであれば可能な限り150bp以下で、できれば100bpくらいで取るようにしています。
400bpでやっている人は、特異的なプライマーを設計する上で仕方なく…という感じなんじゃないでしょうか（憶測）検量線と再現性がちゃんと取れればいい…のかなぁ？絶対定量しているということになればよほど予備実験と条件検討をしっかりしていない限り怪しいと言われても仕方ないかもしれないと思います。

お礼

遅くなりましたが回答ありがとうございます。

＞400bpでやっている人
うちのラボでリアルタイムをやっているのは彼だけで、その彼も2～3回ほどしかやっていないので、お話を伺う限りやはり怪しいと思います。

＞可能な限り150bp以下で、できれば100bpくらいで
アラインメントしてホモロジーの低い領域に絞込み、Oligo4.0でダイマーチェックしながら検討し、186bpで設計しました。
まだまだ長すぎでしょうか？なかなか短い距離でダイマー作らない組合せが無いもので…