ベストアンサー 蛍光probeを付けたらタンパク質が消えた！ 2006/07/20 12:04 蛍光probeをタンパク質に付ける反応をして、精製し、SDS-PAGEをしたのですが、バンドがでません。 蛍光probeがバンドの色を消してしまうとかは、あり得るのでしょうか？ みんなの回答 （1） 専門家の回答 質問者が選んだベストアンサー ベストアンサー Chicago243 ベストアンサー率38% (401/1043) 2006/07/21 04:45 回答No.1 おそらく結合するが何カ所かあって、色素のつく数にバリエーションがあるのではないでしょうか?そのため、バンドがディフーズになって検出できなくなったのかもしれません。ゲルを蛍光で観察できませんか?あるいはアクリゲーションができて、流れなくなりウェルかセパレーションゲルのトップでひっかかってるかもしれません。 または精製後たんぱく質がなくなってないか確かめましたか?ゲルとかに吸着してるかもしれませんよ。 質問者 お礼 2006/07/24 10:59 お返事ありがとうございます。やり直します。 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 カテゴリ 学問・教育自然科学生物学 関連するQ&A 蛍光プローブについて なにかの試薬を用い、培養液内の死んだ細胞のたんぱく質と反応させ、細胞を光らせ、肉眼で反応した光を見ることはできるのでしょうか？ 蛍光プローブという試薬を用いて、このようなことはできないでしょうか？ どなたか、ご教示お願いします。 よろしくお願いします。 SDS-PAGEからのタンパク質抽出方法 質問がございます。 粗精製のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥして、 目的のバンドから酵素消化などすることなく、 タンパク質を抽出できると聞いたことがあるのですが、 その方法をご存知の方、いらっしゃいますでしょうか？ 透析チューブ内にいれて電圧かければ良いのかなとも思うのですが。 収量はそれほどいらないかなと思っております。 よろしくお願いいたします。 タンパク質を分離・精製する手段 SDS－PAGEの他に、タンパク質を分離・精製する手段としてはどのようなものがありますか。異なる原理に基づく手段をおしえてください。 天文学のお話。日本ではどのように考えられていた？ OKWAVE コラム タンパク質定量とSDS-PAGE 現在あるタンパク質を精製しています。このタンパク質の同じ希釈のサンプルを使用しても、Lowry法では一定濃度を示し、Bradford法ではまったく発色しません。なのでタンパク質定量はLowry法で行っています。そしてSDS-PAGEをCBB R-250で染色しようとしてもまったく、染色できません。銀染色で行うとぼんやりとバンドが出る程度なのです。これはただ単にタンパク質濃度が低いだけなのでしょうか？それとも何かいい方法があるのでしょうか？教えてください。また何かアドバイスがあったらいただきたいです。 タンパク質の収率 タンパク質の精製を行っています。 SDSで精製の確認したんですが、収率ってどうやって求めるのでしょうか？ 電気泳動について 電気泳動について 電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、タンパク質をバンドとして出現させた際に、近くのバンド同士が接近しすぎていて、あいまいになってしまった際に、そのあいまいになってしまっている個所のゲルを切り出して、再度SDS-PAGEをすることは可能でしょうか。 また、どのようにして一度ゲルの中にバンドとして出現したタンパクを抽出？精製？するのでしょうか。 語彙の使い方等で、不適切な箇所があるかもしれませんが、ご存知の方、ご回答よろしくお願いします。 GST結合タンパク質が精製できません GSTに結合した目的タンパク質が精製できずにいます。 具体的には、グルタチオンセファロースに結合させて、溶解した液をSDS-PAGEで電気泳動した際に、目的のバンドと同じくらいの濃さでで他のバンドが複数出てしまっています。 同じような経験をして、それを解決された方 もしくは、改善する知識をお持ちの方がいましたら教えていただけないでしょうか？ 目的タンパク質は50kDaです。 大腸菌はBL21で, 培養は20℃でOD650=0.4にしてからIPTG 0.1mM加えて、20℃でオーバーナイトしています。 グルタチオンセファロースはGEヘルスケア製です。 カラムではなくバッチ法で精製しています。 どなたかよろしければ教えて下さい。 蛋白質の可溶化 GST融合蛋白質を作製・培養した後、sonicationによって可溶化の誘導を行いました。 SDS-PAGEによって可溶化の確認を行ったのですが、目的蛋白質以外のバンドが目立ちました。 何度実験してもそのような結果で、大学院生に「蛋白質が壊れているか、不要な成分が溶け出しているんじゃないか」と教えてもらったのですが、不要な成分とはどういうことでしょうか？ 教えてください。 たんぱく質の分子量 SDS-PAGEによりたんぱく質を分子量ごとに分離したのですが、 どれがなんのたんぱく質なのか、 同定するための資料を見つけられないでいます。 SDS－PAGEでは確実な同定はできないのはわかっているのですが 推測程度でわかっておきたいのです。 約１１０、６０、５０，４５，４０kDaのたんぱく質がなんなのか、 今日中に知りたいのです！ ご協力お願いします。 蛍光プローブを用いる疎水性評価 現在、蛍光プローブを用いて疎水性評価を行っています。ですが、なぜプローブの周りの環境が疎水的になると蛍光を発するようになるのかがわかりません。分子内電荷移動が起こっていることまではわかったのですが、具体的にはプローブにどんな現象が起こっているのでしょうか？よろしくお願いします。 リン酸化された蛋白の分析 培養細胞から蛋白を抽出し、リン酸化蛋白をウェスタンブロッティングで同定する実験をしているのですがなかなかバンドがでません。ポジコンのリン酸化されてない蛋白はきちんとバンドがでてます。 リン酸化蛋白を抽出する際のlysis bufferや手技の留意点、SDS-PAGEの際の留意点等ありましたら教えて頂けませんか。 同じタンパク質なのに分子量が違うのはナゼ？？ 今SDS－PAGEを扱っています。 あるタンパク質についてなのですが、 SDS-PAGEを用いて分子量を測定したら３万になり、 変性させずにゲル濾過クロマトグラフィーを行うと１２万でした。 実験操作がおかしいわけではないと思うのですが、いろいろと調べてみても納得のいく答えが出ません。 このタンパク質についてどのようなことが言えるのでしょうか？？ ぜひ教えてください。 日本史の転換点？：赤穂浪士、池田屋事件、禁門の変に見る武士の忠義と正義 OKWAVE コラム 赤色蛍光タンパクと… レポータータンパク質としてDsRed2を使用した場合についてですが、 DsRed2のみの発現⇒赤色 DsRed2とGFP(緑色蛍光タンパク)が発現⇒黄色 というのは、知っているのですが… DsRed2とYFP(黄色蛍光タンパク)が発現⇒？？ 自分では、論文等の文脈からも緑色かなと思っているのですが 確信が持てません。 インターネットで検索しても見当たらないので、 誰か助けてください。よろしくお願いします。 タンパク定量とSDS-PAGEについて タンパクを大腸菌で調製した後、SDS-PAGEで確認し、タンパク定量を行っています。 SDS-PAGEで見る限り、そこまで収量があるようには見えないのですが、タンパク定量をすると、かなりの収量がある結果になります。 そういうことはあるのでしょうか？？ 検量線はBSAです。 よろしくお願いします。 PAS染色による糖鎖（糖タンパク）検出 タンパク質の精製を行っており，精製されたタンパク質が糖タンパク (glycoproteins) であるかを確認したいです． 検出方法として膜に転写した後 PAS 染色で検出する方法があることを知ったのですが，調べてみると SDS-PAGE で泳動後ゲルを直接PAS染色できるみたいです．（SIGMA からでている Glycoprotein Detection Kit みたいなキットを使わずに今ある試薬で行いたいです） その方法（プロトコール）が書いてあるサイト・参考書等，ご存知の方よろしくお願いします． 低分子蛋白量のSDS-PAGEについて 分子量15kDaの蛋白質を15%SDS-PAGEでウェスタンブロティングしています。それまでとてもきれいに出ていてloadingする蛋白量もかえていないのにここ数週間、突然バンドがでなくなったり、でても細く極端にまがったりするようになってとても困っています。Sample buffer(loading buffer)を手作りしており、その影響かもしれないとおもって何度もつくり直すのですが同じ結果です。 何がいけないのでしょうか？ タンパクの分子量マーカーを教えてください SDS-PAGEで用いたタンパク質分子量マーカーなのですが、いつも用いている物と違うがメーカーが分からないので、どこのメーカーの何という製品なのかを調べています。 そのマーカーの特徴としては、まず、バンドが12本に別れ、しかもマーカーのうちいくつかは（染色をする以前の泳動の段階で）普通の青色のバンドと、それに加えて紅いバンドが混じっていました。先輩からは、メーカーはよく分からないが、新製品の筈だと聞きました。情報が不足しているのでこれ以上書けないのが残念ですが、どなたかご存知の方、教えてください。ちなみに上から6、7、9、10番目に濃いバンドがあります。 SDS-PAGEゲルのトラブル あるタンパク質を生体物質から私の研究室（かなり小規模な研究室なので聞ける人があまりいないのです。）では精製していて、随分以前からそのタンパク質が精製できているかどうかをSDS-PAGEゲル上で確認していました。 ところが、ここ1ヶ月ほど前からそのSDSーPAGEゲルの電気泳動結果がおかしいのです。。 例えば、 *本来あるはずの低分子タンパク質のバンドが薄くしか（もしくは全く）見えない。高分子領域にスメアがたくさん見える。 *本来サンプルがアプライされているはずのないレーンにスメアっぽいバンドがたくさん見える。（特に高分子領域に） *バンドはかなりスメアっぽく見える。（シャープなバンドではない。） あと気づいたことですが、泳動直後のゲルはかなり暖かくなっていました。 このような原因として何が考えられるでしょうか？本当に困っています。 ちなみに、私たちの研究室では、 *SDS-PAGEゲルは自作 ポリアクリルアミド、SDS等を水溶液にしたものが冷蔵庫にストックされていて（2.3ヶ月前に作られました）、その水溶液と常時調製している10％APS溶液そしてTEMDを混ぜ合わせて常に作っています。 *ローディングバッファー 半年ちょっと前に作られて冷蔵庫にストックされたものを使っています。 *泳動用バッファー 10倍のTrisベースのバッファーが常温でストックされているので、それを随時希釈して使っています。 *泳動条件 150V（電気泳動ユニットに異常は見られません。） ジスルフィド結合を多数（１５以上）持つ蛋白質をトリプシン消化しています ジスルフィド結合を多数（１５以上）持つ蛋白質をトリプシン消化しています．しかし上手く消化がいきません（SDS-PAGEで未消化バンドを確認済みです）．そこで質問なのですが，ジスルフィド結合が多数存在し，酵素消化反応がいきにくい蛋白質を効率的に酵素消化する方法をお教えいただけないでしょうか？実際のプロトコール（in solution）でお教えいただけるとうれしいです．よろしくお願いします． SDS-PAGEで分離したタンパク質のバンドの太さは、どのような条件に依存するのですか？ SDS-PAGEでタンパク質を分離したとき、同じタンパク質でもバンドの太さ(泳動方向)が太かったり、細かったりしてしまいます。これは、どの泳動条件によって変化しているのでしょうか？私は次のような原因を考えましたが、正しいかは分かりません。 ゲルの濃度に依存していると考えた場合、アクリルアミドの濃度を高くすると、バンドは細くなると考えてよいのでしょうか？また、濃縮ゲルの高さに依存していると考えた場合、濃縮ゲルを長くすると、タンパク質はより濃縮されバンドは細くなるのでしょうか？ ご存知の方、回答を是非お願いいたします。 注目のQ&A 「You」や「I」が入った曲といえば？ Part2 結婚について考えていない大学生の彼氏について 関東の方に聞きたいです 大阪万博について 駅の清涼飲料水自販機 不倫の慰謝料の請求について 新型コロナウイルスがもたらした功績について教えて 旧姓を使う理由。 回復メディアの保存方法 好きな人を諦める方法 小諸市（長野県）在住でスキーやスノボをする方の用具 カテゴリ 学問・教育 自然科学 理科（小学校・中学校）化学物理学科学生物学地学天文学・宇宙科学環境学・生態学その他（自然科学） カテゴリ一覧を見る OKWAVE コラム 突然のトラブル？プリンター・メール・LINE編 携帯料金を賢く見直す！格安SIMと端末選びのポイントは？ 友達って必要？友情って何だろう 大震災時の現実とは？私たちができる備え 「結婚相談所は恥ずかしい」は時代遅れ！負け組の誤解と出会いの掴み方 あなたにピッタリな商品が見つかる！ OKWAVE セレクト コスメ化粧品 化粧水・クレンジングなど 健康食品・サプリ コンブチャなど バス用品 入浴剤・アミノ酸シャンプーなど スマホアプリ マッチングアプリなど 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お返事ありがとうございます。やり直します。