配列が読めない！！

質問

非常に困っています！！どなたかよろしくお願いいたします。

現在使用しているシークエンサーのタイプはアクリルアミドゲルを使用したいわゆる『ゲル板』タイプのものなのですが、200～300bpまでは読めるもののそれ以上の部分が読めません。過去に読んだ人のデータを引っ張り出してみたのですがその場合は500bp程度まで確実にバンドが確認できていました。PCR反応もアクリルアミドゲルの調整もこの以前の方の方法を参考に行っているのですが、この差はいったい何なのでしょうか？

可能な限りのお知恵をいただけると幸いです。よろしくお願いいたします。

回答No.2

MIYD · ベストアンサー

前のラボで
Li-corのシーケンサー(66cmと2/3位のサイズのゲル板で、1色のやつ)
SequiTherm EXCEL II
Long Ranger
を使っていました。

バンドがブロードになっていて、
ポジコンでも変わらないということで、
おそらくゲルの問題だと思います。

ゲルの組成は間違っていないと思いますし、
(ureaやTBEの入れ忘れとかはないですよね)
脱気はしなくてもあまり違いはないようです。
初めは読めているので、ゲルの上面が乾いてDNAが入っていかないということでもないと思います。

ゲルはどのくらい固めているのでしょうか。
前のところでは昼作って夜流すと泳動がおかしいときがあったということで
(どうおかしくなったのかは聞いていませんが)
ゲルを入れてから一晩固めていました。

吸熱反応なので、エアコンがあたらないようにとも言われました。
(帰りにエアコンを切るラボだったのであまり関係ありませんでしたが)

もし、ゲルを作ってその日に流しているのでしたら、
一度、一晩風のあたらない室温のところに置いてみてはいかがでしょうか。

お礼

返信ありがとうございます。

ゲルの重合時間はマニュアル通り約4時間で行っていたのですが、やはり足りないのですね...今度は乾燥しないように気をつけつつ一晩固めてみたいと思います。こちらは東北地方なので朝晩がちょっと寒いのですが何とかがんばってみたいと思います。

本当にありがとうございました。

回答No.1

MIYD

キット、テンプレート、プライマー、反応条件、読めない部分の止まり方、行ったコントロールについて何も参考になることが書かれていないのでは、
知恵も何もないと思いますが。

キットに付属のポジコンでも止まるのですか。

過去に読んだ人と同じテンプレート、プライマーでも質問者さんが操作すると止まるのですか。

アクリルアミドはシーケンス専用のものでしょうか。
使用期限が切れていませんか。(1年くらい切れていても問題はありませんが)

テンプレートが200~300bpで終わっていませんか？
(PCR productや制限酵素処後など)

読めなくなっている部分がヘアピン構造などを取っていませんか？

読めなくなっている部分がGC-richだったりしませんか？

とりあえず、どこに問題があるのかを調べるために、
ポジコンと一緒に流してみてはいかがでしょうか。

補足

すみませんでした。今までの研究室ではキャピラリータイプのシークエンサーしか使用したことがなく新しい研究室でまったく違うシークエンサーになってしまって何から質問したらよいかわからない状態でした。ご了承ください。

使用機器；LI-COR社製Model 4000シリーズです。
キット：USB CorporationのThermo Sequenase Cycle Sequencing Kitです。
テンプレート：pBlueScript SK+内にある約800bpの結核菌由来のDNA断片です。
プライマー：M13 Reverse Primerです。
反応条件：反応条件はキット及び機器に付属のマニュアルに従って行っています。
読めない部分の止まり方：最初はきれいな楕円のバンドが確認できるのですが200bp付近からバンドが崩れはじめ、（前任者の場合、最初と同じ大きさのバンドが350bp以上まで保たれているが、約2～3倍の大きさのバンドになり、かつ強度が低くなってしまっている）350bp付近では何も検出できません。バックとほぼ同じ状態です。

コントロールに関してもキット付属のものを用いましたが、サンプルと同じ状態です。
また前任者は同じサンプル、プライマーにて実験を行っていますが成功しています。
アクリルアミドはLong Rangerという専用のもので使用期限内です。そのほかの試薬に関しても特に問題はなくAPSに関しては使用直前に調整しています。
ヘアピン、GC-richに関しては確認しましたが特に問題となるものは確認できませんでした。

以上、補足をさせていただきます。よろしくお願いします。