タンパク質の局在と抗体

質問

タンパク質の細胞内での局在があると思いますが、どうやって調べているのでしょうか？膜に局在したり、細胞質内だったり、核内だったり。なにか調べる方法があったら教えて下さい。あと、FACSのシステムですが、膜タンパク質の細胞表面のエピトープに反応する抗体を持っていないとできないのですか？核内や細胞質内ではだめでしょうか？
よろしくお願い致します。

回答No.3

lamb1204 · ベストアンサー

1です。

>「１．蛍光タンパク質を融合したタンパク質の発現解析」とはなんでしょう？酵素抗体法とは異なるのでしょうか？
GFPをはじめとする蛍光タンパク質は、ある波長の光を吸収して、他の波長の光（＝蛍光）を出します。したがって、目的タンパク質と蛍光タンパク質を連結した一次構造を持つ融合タンパク質を発現させるコンストラクトを作製し、細胞内で一過的に発現させます。そして、その細胞内で融合タンパク質が、細胞内のどこに局在するのかを、共焦点レーザー顕微鏡などによって蛍光タンパク質の蛍光を観察することで解析します。

>「４．蛍光抗体法」は固定処理せずに、生きた細胞が染まったら細胞膜ってことでしょうか？
蛍光抗体法は自分では試したことが無いのではっきりとはいえませんが、それだけで細胞膜と言い切るのは微妙な気もします。複数の手法による結果を照らし合わせたほうがいいのではないでしょうか。

>この場合は、検出できなかった場合なのでしょうか？核と細胞質のように分かりやすいときのみ判別可能ということでしょうか？
おそらくはっきり判別可能なのは、核とプラスチド（植物屋なので）でしょう。細胞膜とサイトゾルを区別するのは難しいように思います。ペルオキシソームやミトコンドリアなどは、どちらかは判断つけられないかもしれませんが、「小胞あるいは顆粒状の構造物」くらいには判断できると思います。あと、組織免染で判別可能かどうかは、細胞一個の大きさにもよります。

お礼

詳細までありがとうございます。
なんだか局在を知るのは、結構大がかりなことなんですね。
今の私のラボではできそうにありませんが、
今後の参考にさせていただきます。
ありがとうございました。

回答No.2

ebikichi

細胞内にGFPなどの蛍光蛋白質を発現させれば、FACSは可能です。

最近、研究から遠のいてしまったので、最新のことはよく知りませんが、FACSでFRETが使えるでしょうか？
もし使えればかなり応用が利くと思います。

お礼

回答ありがとうございます。
残念ながらFACSがないので、実験はできないんです。すいません。
最近はFACSでFRETは使えるらしいですよ。でも分子間の距離とタンパク質の局在は関係するのでしょうか？
もしわかりましたら教えて下さい。

回答No.1

lamb1204

タンパク質の細胞内での局在性を解析する主な手法をいくつか挙げます。

１．蛍光タンパク質を融合したタンパク質の発現解析
２．免疫電子顕微鏡解析
３．オルガネラ分画
４．蛍光抗体法

また、局在によっては、ABC法で検出した免疫組織染色解析でもわかることがあります。

それぞれの手法について調べて分からないことがあれば、再度質問してください。

補足

「１．蛍光タンパク質を融合したタンパク質の発現解析」とはなんでしょう？酵素抗体法とは異なるのでしょうか？
「４．蛍光抗体法」は固定処理せずに、生きた細胞が染まったら細胞膜ってことでしょうか？

＞局在によっては、ABC法で検出した免疫組織染色解析でもわかることがあります。
私の経験だと、パラフィン切片した細胞の細胞膜と細胞質のタンパク質の検出でABC法を用いたのですが、同じ（似た）ように観察されました。この場合は、検出できなかった場合なのでしょうか？核と細胞質のように分かりやすいときのみ判別可能ということでしょうか？