制限酵素SmaIによるプラスミド切断について

質問

TOYOBOさんのSmaIと付属の専用バッファーを用いて、大腸菌DH5αで増やしたプラスミドを切断しようとしているのですが、なかなか切れません。

大腸菌内ではSmaI認識配列はメチル化されにくいとは思うんですが、どうなんでしょうか？

単に活性が低いから反応時間が足りないだけなんでしょうか？

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

大腸菌で殖やしたDNAはdamとdcmのメチル化だけ注意しておけばまず間違いなくて、SmaIはセーフなはずですね。

SalIでは切れているのを確認してから次の操作に移っているのでしょうか。
プラスミドが切れにくいことではSalIのほうが桁違いですから、これで切れているのなら、精製度の問題などで切れなくなっているという可能性はなさそうです（余計なことですが、SalIのあとはEtOH沈殿だけで十分ではないでしょうか。フェノール抽出によるロスや阻害物質の持ち込みのリスクが増えるだけで）。

それとSmaIは37℃での活性が30℃のときの半分くらいだったと思いますが、何度で反応しましたか？　まあ、それにしたってたとえ活性が半分でも全く切れなくなることはないですけれど。

結局、考えにくいけれど可能性としては、
・SmaIサイトが実はない、あったけれどつぶれている。
・SmaIがとんでもない不良品（念のためλDNA標品などを消化してチェックしてみては）。

お礼

ありがとうございます。

Sal1で切断後、泳動して切り出した物をSma1で切っています。
Sal1は4時間程でスッパリ切れました。

Sma1は30℃でover nightしても切れてませんでした。

この操作に関するOBの実験ノートが残ってなかったのですが、先日、本人に連絡をとり、どうやって切ったか確認しました。

どうやらTakaraのSma1とT bufferとBSAで切断し、その後Sal1で切断したようです。

まずはこの方法で試してみたいと思います。

回答No.3

MIYD

本当にメチル化が原因だと考えているのならば、
XmaIで切ってみてはいかがでしょうか。

SmaIと同じ認識配列で,メチル化の影響を受けません。

切る目的が分かりませんが、
サブクローニングであれば、XmaIは突出末端なので悪くはないと思います

お礼

ありがとうございます、もしまだ上手くいかないなら、Xma1試してみたいと思います。

回答No.1

MIYD

実験のコントロールに何をしていますか？

汚いプラスミドはどの酵素でも切れません
失活した酵素には活性はありません

1切りたいプラスミドが別の酵素では切れるか
2使用しているSmaIは他のプラスミドを切断出来るか
3隣のラボから借りたSmaIは切りたいプラスミドを切れるか

を確認してみてはいかがでしょうか

お礼

ありがとうございます。

Sma1は酵素もバッファーも注文したての新品で、プラスミドはSal1で切断後PCIとエタ沈したものを使っています。

Sma1はメチル化で切断が阻害されると書いてあったのですが、大腸菌で増やしたプラスミドは大丈夫だと思ったんですが、どうなんでしょう？
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100002660

とりあえず、プラスミドをCIA、エタ沈してもういちどやってみたいと思います。