トランスフェクションの失敗原因

質問

今cos細胞を用いてトランスフェクション効率48hで行い、その後ポジコンとしたpCH110の固定、染色を行っているのですが、overnightでincubateしても、黄色のままです。教授曰く、それは細胞の扱いが悪く、普通は染色してから20min～1hで青く染まるというのですが、私の場合、全部が青く染まるのではなく、一部が染まっているだけなのです。一応70%～80%のコンフルエントにしてからトランスフェクションを行っているのですが何が原因かわかりません。わかる方いらっしゃったら教えていただけますか？

回答No.2

Chicago243 · ベストアンサー

COSは比較的導入が簡単な細胞です。プラスミドの質が悪くないか(ニックが入っていたり、トランスフェクションするのに十分きれいかなど)、条件が妥当かなどを検討すれば非常に効率よく、強い発現が見られると思います。特に燐酸カルシウムを使ったトランスフェクションは最初は条件の検討に時間をさかないと行けないと思います。顕微鏡でも見えるか見えないかの非常に小さい粒ほとんど黒い点のような沈澱が必要です。

そのほかの試薬の場合はそのマニュアルやトラブルシューティングを参考にして、条件を探るべきでしょう。Lac z染色の試薬、固定方法とかは大丈夫ですか?確認してみてはどうでしょうか。

回答No.1

MIYD

トランスフェクション効率48h？

時間などを書くよりも入れ方やDNA量やどのように染まったかなどを書いた方が参考になると思います
教授には一般論ではなく、次に行うときの注意点などを言わせた方がいいかと思います

不均一というのが線状やまだらなら
リポソームかリン酸カルシウム共沈殿かわかりませんが、
ピペットでいれたところだけ入っていたり、全体的に入っているところと入っていないところがある染まり方だとこの可能性が高いです

細胞一個一個でまだらならば、
それらの出来が悪くてあまり入っていないのだと思います
新しく調製したベクターが汚かったり、混ぜ方や待ち時間、温度などに問題があったのではないでしょうか

補足

pCH110は2μl入れています。
固定・染色してから24h後に見てみると、細胞一個一個がまだらに染色されているという状態です。