annealing bufferの作り方

質問

oligoをligationする際、annealing bufferを使うよう、plasmidをくださる研究者から指示されました。
recipeは
200mM potassium accetate
60mM HEPES-KOH pH7.4
4mM Mg-acetate
さて、どうやって作ればいいのでしょうか。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

1Mのpotassium accetateを40ml位つくる。
1MのHEPES-KOH pH7.4を500ml位つくる。
1MのMg-acetateを40ml位つくる。

8ml of 1M pottasium acatate
2.4ml of HEPES
1.6ml of Mg-acetate
DDWで40mlにメスアップ

計算とストックソリューションが溶ける濃度かどうかは自分で確認してください。
ストックソリューションを作る量は自分が今後どのくらい使うかを考えて調節してください。

お礼

大変詳細にご教示いただき、ありがとうございます。
もう一つ質問なのですが、HEPES-KOHは、まずHEPESを作り、それからKOHを加えて、滴定するのでしょうか。
ただ、後からKOHを加えると、量によってはHEPESの濃度が薄くなってしまうと思うのですが。
いかがでしょうか。

回答No.3

MIYD

もう作り終わったと思いますが‥
少し濃い目(大体8割くらい？)の状態(No1の場合だと400ml位)の水に必要なHEPESを溶かして、
その状態でpH調整をします。

その後で500mlにメスアップします。
pH調整用のKOHが薄かったり、あらかじめ溶かしておくvolumeが多いと、
最後にメスアップができなくなりますので注意してください。

お礼

ありがとうございました。
調整方法、よくわかりました。
３日から実験を再開します。
早速、annealingをしたいと思います。

回答No.2

MIYD

Mg-acetate は160ulですね