生物 RNAの計算

質問

total RNAを計算するためにサンプル量が知りたいのですが、それがよく分かりません。ハエ30匹を200μでホモゲナイズし.さらに800μl加えたので1000μlになるのでしょうか？基本的な質問ですいません。お願いします。

回答No.3

hiddenleaf

私のイメージでは、
ホモジナイズ→タンパク除去→エタ沈→溶解→RNA濃度測定
ですので、最後の溶解で用いた溶媒量が重要だと思うのです。
例えば、最後に200μLの水に溶解したのなら、total RNA量は
80.8μg/mL×0.2mLで16.16μgとなります。

ホモジナイズ→RNA濃度測定
というスタイルであるのなら、確かにホモジナイズ後の液量が重要です。
しかし、そのようなRNA抽出方法は聞いたことがありません。
プロトコルをよく確認してみてはいかがでしょうか。
もし存在するのであれば、私の知識不足により混乱させてしまったことになります。
申し訳ありません。

ちなみに、その方法が存在する場合、私であれば約1000μLとなった液から
950μL程度を採取し、正確な液量とします。

回答No.2

yuklamho

『すいません。どうして関係ないのか教えて下さいm(_ _)m濃度が80.8μg/mlだったので、それにサンプル量を書ければ全RNA量が出ると思ったのですが』
もしかして、ホモゲナイズした上清の濃度を測ったということでしょうか？それなら破砕液の量にこだわる理由は解ります。まず、元々の質問に対する答えから答えると。

ホモゲナイズすればハエの身体の中から液体も出てくるでしょうしホモゲナイズの仕方によってはロスもあると思います。それがどれくらいかはわかりませんが、ホモゲナイズした後に遠心分離して上清だけを新しいチューブに移せばピッペトで大まかな容量を知ることができると思います。それで、答えになっているでしょうか？

それから、回答者#1さんの言っていることは、普通はその上清をフェノールやクロロフォルムで抽出したりカラムを通して精製します。でないと、淡白シュツなど多くの不純物を含んでいあるから濃度も測れないし実験に使えないのです。だから、精製した後の液体の量が大事であって破砕液の量にこだわる必要はないでしょと言っているわけです。

質問の答えになっているでしょうか？

回答No.1

hiddenleaf

「total RNAを計算するため」に重要なのはエタ沈後、RNAを溶かす溶液のボリュームだと思うのです。
ハエの破砕液の量はどうでもいいんじゃないでしょうか。
この部分をあえて答えるのなら、1000μLで良いです。
でも800μLだろうと1200μLだろうと、そこのボリュームはどうでもいいです。

お礼

ありがとうございました！

補足

すいません。どうして関係ないのか教えて下さいm(_ _)m
濃度が80.8μg/mlだったので、それにサンプル量を書ければ全RNA量が出ると思ったのですが…。初心者ですいません(~_~;)