RNA用器具・試薬

質問

RNAの抽出をしたいのですが、器具や試薬で困っています。

１、RNase Freeを保つために、試薬は全て未開封のものを使わなけらばなりませんか？

２、チューブ等はすべて滅菌済みの物を買うべきでしょうか。未滅菌のチューブを普通にオートクレーブ滅菌（１２１℃で２０分）したものは使ってはいけないのでしょうか。

３、ガラス器具は、すべてDEPC処理をしたものでなくてはならないのでしょうか。
例えばRNA用８０％エタノールを作るとき、エタノールをメスシリンダーで測ろうとした場合、そのメスシリンダーもDEPC処理をしたものでなくてはならないのでしょうか。

４、RNase Freeでないものを一回でも使った場合、その産物はRNaseが混入し、失敗品となるのでしょうか。それともRNA量がちょっと減るくらいでまだ実験可能なのでしょうか。

基本的な上わかりにくい文章で申しわけございません。様々な器具や試薬を使う予定ですので、全ての試薬を未開封のもの、全ての器具をDEPC処理したもので実験を行おうとすると大変な作業になりそうですので質問させて頂きました。どなたかご教授下さい。

回答No.1

oyaG · ベストアンサー

ずぼらな私の経験からは，

１）No
２）Yes
３）No
４）case-by-case

RNAを対象とする実験をするにあたり，いろいろ気にされることはとってもよいことだと思います．ただ，私の研究所で分子生物をやっている連中でも，RNaseに大変神経質なタイプとそうでないタイプがいます．おそらく，最初にRNAの操作をならった大学のラボでの習慣を引き継いでいるんだと思います．

必要以上に神経質になるのは非効率であり，また非必要なコストもかかるのでよい事だとは思いません．これから研究者としてやっていくことを志されているのでしたら，ご自身なりにどのポイントが大事かをご自身なりに検証しながらやられるのがよいと思います．

たとえば，唾液やラボの塵をRNAサンプルにわざと入れて実験操作をしてみて，結果にどんな影響が出るかを検証してみるとかです．いずれにしても，器具試薬は極力，個人専用のものを確保する必要があると思います．

器具試薬には「RNA専用」と明記する，500mLビンの試薬などは50mLのチューブなどに小分けして使用，ビンに直接ピペットを突っ込まないとか，いろいろ世間のラボでやられていることは参考になると思います．

下記サイトの，「実験技術（バイオ・酵素・試薬・動物）マニュアルを参照する」からいろいろたどってみられるといいと思います．

参考URL：

http://www.biwa.ne.jp/~fumika/

お礼

有難うございます。私の周りには経験者がおらず、一人で考え込んでしまい全然先に進めないでいました。本当におっしゃるとおり非効率ですよね。ご回答、サイトとも大変参考になりました。

回答No.4

cooh

どのような場合に失敗するのか。
いろいろあるとは思いますが、思いつくのを書いてみますと、

RNAを調整する最初の段階なら、そもそも試料にもRNaseがたくさん含まれて
いるでしょうから、多少の混入は影響しないと思います。
しかし、精製最終段階のRNAを「RNaseを使ったピペットマンで、
フィルターなしのチップで吸ってしまった」なんて状況は避けたいですね。

また、目的のRNAがすごく発現量の多いものであれば、わずかに分解しても
それほど影響はありませんが、ごく微量にしか発現していなければ、
わずかのRNase混入が結果に響いてくると思います。

曖昧な書き方をして心配させてしまったかもしれませんが、
運は（ほとんど）関係ないです(^^;)　おそれることはないですよ。

お礼

ご回答有難うございます。本当に参考になりました！
あとは実際に色々やってみます。皆様に心より感謝いたします。

回答No.3

cooh

No.1さんの回答と似ていますが…
1. ものにもよりますが、できればRNA専用のものを使うのが良いと思います。
2. 素手で触っていなければ、オートクレーブ滅菌で問題ありません。
3. stock solutionは、普通に作ってガラス瓶に入れてからDEPC処理。
それ以外に使う瓶やガラス器具は乾熱滅菌してから使う。などでしょうか。
80%エタノールについては、正確さよりもRNase混入の機会を減らすために、
メスシリンダーを使わず、瓶の目盛りに合わせて直接作ってしまっています。
4. 場合によります。ほんとに。

実験中は、話を極力しない、もしくはマスクを着用することを勧めます。
うまくいくとよいですね。

お礼

励ましのお言葉まで有難うございます。ご指導のとおりにやっていこうと思います。質問「４」のお答えに関してですが、どのような場合に失敗するのでしょうか。どこかでRNaseがたくさん入ってしまった場合？それとも、単に運が悪かったと考えるしかないのでしょうか。

回答No.2

oyaG

回答者＃１です．誤記がありましたので，訂正させてください．

2)はNoでした．
私の場合，未滅菌のチューブを500mLくらいのビーカにいれてアルミフォイルで蓋をしてからオートクレーブをかけて使ってました．その間，素手で触ることのないように注意してます．
ピペットのチップは，RNAのストックサンプルを直接扱うときに限ってRNase Freeでフィルタつきのチップを使用してます．