現在の私の研究で、マウスの脾細胞におけるサイトカイン遺伝子の発現量（正

質問

現在の私の研究で、マウスの脾細胞におけるサイトカイン遺伝子の発現量（正確にはTh1、Th2細胞の多さ）をRT-PCRで検討しようと思っています。サイトカインの発現をより簡易にモニタリングするために、脾細胞から分離したCD4陽性細胞をPMAとIonomycinで刺激した後にRNAを調製しようとしています。
その際にCD4陽性細胞の精製が必要になるのですが、始めはMiltenyi Biotech社のMACSシステムを用いて行っていたのですが、コストの関係から現在BD社のFACSAriaIIを用いて精製を試みています。
当然ながらガイドに基づいて行うことで目的細胞の精製はうまく行っているのですが、どうしてもその後の刺激培養の段階でコンタミが起こってしまうのです。
通常のプロトコールに加えて、FACSの操作中に何か特別な工夫をされてる方がいらっしゃったらご享受いただけませんでしょうか。

尚、マウスの屠殺から蛍光標識抗体反応、FACSサンプル調製まで全て無菌操作で行っており、FACSに供する直前の細胞をPMA+Ionomycin条件下で48時間培養しても（意味のない培養ですが）コンタミは見られないので、確実にFACSにかけること自体がコンタミの原因になっていると考えられます。
また、FACSのラインの無菌化は確実に行っており、過去に無菌状態でないサンプルが流された履歴もございません。
もし提案のある方がいらっしゃったら、ご回答宜しくお願い致します。

回答No.3

tatoo

>FACSのラインの無菌化は確実に行っており、

ちなみにどうやってでしょうか？

私はソーティングを行なう時、普通の部屋に置いてある機械でやっていますが
特に、コンタミが起こったことはありません。

そもそも、培地にバクテリア用の抗生物質は入れてあれば
２４時間くらいの培養で目に見えておかしくなることがあるとしたら
それは、強烈に何かに問題があると思われます。

シース液のものすごいコンタミとか、ノズルの強烈な汚れとか。

一度、ソーティングに使う機械以外のモノのチェックを行なってみては？
シース液とか。

あと、ソーティング後の細胞液を一度遠心して、液を交換してから培養に入るとかすれば
ちょっとはましになるかもです。

お礼

遅くなりましたが、ありがとうございます。
ラインの殺菌は通常のエタノール殺菌です。2,3日以内に使用しない時は、ラインのシース液を全てエタノールで置換しています。
また、シース液自体は購入したものをそのまま使用していますが、シース液タンクについては基本1ヶ月に1回、大事なサンプルの時には都度行っております。
分取後のサンプルは相当細胞濃度が低いので、一度遠心して培地に浮遊後、細胞濃度を計測して再度遠心を加え、所定の濃度になるように培地に懸濁しています。

ノズルはガイドに載っているように滅菌水で軽く洗う程度しか行ってません。
ルーペを使って見た感じはつまっている等の問題はないのですが、この辺も洗浄操作を加えていろいろやってみようと思います。

回答No.2

BALB

まずはどの時点でコンタミしているか確認したほうがよろしいのではないのでしょうか？
コンタミが発生してる時点で無菌ではないところがあるはずですよね。

補足

大きくとらえると、前述のようにソーティングの段階でコンタミしているんですが、FACS装置自体がUV照射室にあるわけもなく、装置にサンプルをセットする時と、ソートされたサンプルを回収するところで必ずオープンの操作が入ってしまうんですよね。
ですので、何か個人的に工夫をされている方がいらっしゃればと思い、今回の質問をさせていただいております。
ベンチ内でMACSをやってしまえば確実に無菌にはできるんですけどね・・・。

回答No.1

alanami

セルソーターのことは詳しくないのですが、気になることがあったため
コメントします。
PMA・Ionomycin刺激してからRNAを調整しているとのことですが、
コンタミが分かる程の長時間（２４～４８時間）も培養しているんで
しょうか？mRNAを検出するのに、長くないですか？

目的の遺伝子にもよると思いますが、PMA・Ionomycin刺激で細胞内
のサイトカインをFACS解析するのでも、刺激時間は数時間です。
RNAはあくまで発現の目安ですし、IFN-gやIL-4の抗体があるのであれば、
タンパクレベルでの細胞内サイトカインの検出が確実かと思います。

補足

サイトカイン自体を検出するのであれば、48時間培養はよくやってあるようでした。あと、簡易に書いてしまって申し訳なかったのですが、最終的な検出対象は炎症性のサイトカイン、ケモカインを網羅的に解析したいのです。
確かにRNAでのレベルを見るのであれば、もっと早くてもよさそうですね。
ただ12時間培養でもコンタミした菌が目視で確認されてしまいます・・・。
4時間培養ほどだとPCRの増幅が弱かったので、できるだけ長い時間まで経時的に試してみたいなと思っている段階です。
ちなみに、IFN-gやIL-4のFACS用蛍光標識抗体は持っています。