局在化シグナル配列

質問

局在化シグナル配列がＤＮＡのどの部分にあるかというのは
どのような実験をすれば決定できるのでしょうか？

すみませんが分かる方教えてください。

回答No.2

Kohntarkosz

N末端にシグナル配列がある場合はアミノ酸配列から調べるのがよいかもしれませんよ。まず、目的のタンパク質を大量に発現させ、局在が正しいことを確認した後に、タンパク質を精製します（抗体カラムでもよいし、タグ付きタンパク質にしてそれに対するアフィニティ精製でもよい）。得られたタンパク質を電気泳動後、メンブレンに転写し、アミノ酸シークエンサーを用い、N末端配列を決定します。得られた配列と前駆体タンパク質の配列を比べるとプロセスされた部位が決定できます。次に、この領域を用いてGFP融合タンパク質を発現させてみます。傾向顕微鏡観察およびウエスタン解析で局在が確認できたら、候補となる領域全てがシグナル配列かを調べるためにトランケートシリーズを作製して、同様に局在を調べます。ここまでやればかなり領域を特定できてくるのではないでしょうか？
ただし、膜タンパク質の場合、局在化シグナルが配列の中程にあったり、シグナル配列がふたつの領域で構成されていたりします。この場合は様々なトランケートシリーズを作製して実験する必要があるので、ケースバイケースでいろいろやっていく必要があると思います。

回答No.1

noname#67386

パターン化されたもの(例えば典型的なオルガネラ移行シグナル等)はGENETYX等のDNAシークエンス解析ソフトで推定および検索できます。
wikipediaにも代表的なシグナルのいくつかは挙げられているようです。
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B7%E3%82%B0%E3%83%8A%E3%83%AB%E3%83%9A%E3%83%97%E3%83%81%E3%83%89

実験的に証明する場合、移行シグナル配列にレポーター遺伝子をつなぎ合わせた配列を
組み換えにより観察しやすい試料に導入、一過性発現を観察すれば証明できます。
多少の設備と腕は必要だそうですが。