SDS-PAGEで、ゲルを作製するときに重層する蒸留水について

質問

SDS-PAGEでゲルを作製するとき、分離ゲルに蒸留水を重層します。しかし、かなりそっと重層しても分離ゲルと蒸留水が混ざってしまい、ゲルが硬化した後に界面が凹凸のある状態に乱れています。蒸留水を重層するとき、何かよい方法はないでしょうか？また、蒸留水は必ず重層しないといけないのでしょうか？蒸留水を重層しなくても大丈夫なら、重層せずに、分離ゲルが固まった後に濃縮ゲルを重ねようと考えているのですが…？

回答No.1

nativepage · ベストアンサー

アクリルアミドは酸素があると重合が阻害されますし、結局泡なんかで表面が乱れるので重層した方がいいと思います。

改善の余地としては、例えば分離ゲル溶液に～10%程度になるようにグリセロールを入れると比重の違いにより混ざり合いにくくなります。

もしくは、水より比重の軽い溶媒を重層する方法があります。例えば、水で飽和させた1-ブタノールなど。
具体的には50mlのチューブなどに、水とブタノールを半分ずつ位加えてシェイクし静置、ブタノールは上層、水は下層に分離するので上層を使用してください。

どちらか一方でかなり改善されると思いますので、楽そうな方をお試しください。

お礼

回答ありがとうございます。蒸留水は重層しないといけないんですね。教えていただいた方法についても試してみようと思います。

回答No.3

ratmouse

私は200μLのピペットマンなどでゲル板を伝わらせて、重層していますが、特に乱れたことはありません。
以前、重層した直後に、ゲルをシーソーのように揺らしていたことがあったのですが（先輩の教えで）、その時はたまに界面が乱れていました。その後、重層した後には一切ゲル板にさわらないようにしてからは、界面が乱れたことはありませんよ。

TEMEDやAPSの濃度は適量ですか？
ちなみに、ストーブやドライヤーで暖めて早く固まらせようとすると界面が噴火します（しました）。

うまく行くと良いですね。

お礼

回答ありがとうございます。一般的に界面が乱れないのであれば、私のやり方に問題があると思うので、問題点を探ってみます。

回答No.2

nativepage

補足です。

グリセロールは基本的に泳動には影響を与えないので安心して使用できます。
（小さいタンパク質を分離する際に、ゲル内での拡散を抑えるために加えることもあります。）

ブタノールを試す場合は、濃縮ゲル溶液を注ぐ前にブタノールを除き、さらに水か泳動バッファーで分離ゲル上端を軽く洗ってください。
ブタノールが残っていると、濃縮ゲルがきれいに固まらないことがあります。

お礼

詳しい補足ありがとうございました。