サイクリンB1抗体で核染色できません。

質問

現在、蛍光染色を行なっております。
線維芽細胞をビメンチン、サイクリンB1で染めていますが、
ビメンチンはきれいに染まるのですが、サイクリンだけ染まりません。
サイクリンB1なので、核が染まるはずなのですが、何度やっても核以外の部分が染まってしまいます。Triton処理を行なっているので、膜は透過して、核まで染まると思うのですが。
染色手順は以下のとおりです。
4%アルデヒド固定→wash out→0.01%Triton-X→wash out→1%ヤギ血清にてブロッキング→anti rabbit cyclin B1→一晩室温→Alexa488
よろしくお願いいたします。

回答No.3

bzxjpjp · ベストアンサー

サイクリンB1は分裂期(M期）で、強く発現が見られますが間期ではほとんど発現が認められません。

細胞は通常培養下では、大部分が間期ですので染まってこないのだと思います。

核を染めるだけでしたら、DAPI等を使われるのがいいのではないでしょうか。

それと、interphaseは間期です。中期はmetaphseです。

補足

回答ありがとうございます。
論文検索していたところ、ご指摘のとおりでした。
しかしながら、私の実験では、cyclinB1を用いて、その細胞がM期にあることを確認したいのです。FCMという方法もあるのでしょうが。

回答No.4

ga111

染色法でなく、あなたの細胞にどんな特別な処理をしたのか？　それはM期の細胞を増やす操作なのか？を書かないとだれも答えられません。それ以外にもかなり情報収集、基本知識が足りませんよ。

回答No.2

ga111

追加です。
http://www.gurdon.cam.ac.uk/~pineslab/Images/B1-translocation.jpg

特別な処理をしていない限り、ほとんどの細胞はinterphaseにありますが、そのとき、B1は細胞質にあるような叙述がありますけど？　（よく調べてはいません）

補足

回答ありがとうございます。
一応、蛍光には使えると書いてあります。
「特別な処理をしていない限り、ほとんどの細胞はinterphaseにありますが」
これはお恥ずかしながら、初めて知りました。
interphaseということは、中期ということでしょうか。
詳しく調べてみます。
ありがとうございました。

回答No.1

ga111

抗体はウエスタンでつかえても蛍光染色には使えないとかあるのはご存知ですよね。

他のサイクリンB1抗体を使うか、さらにCdk抗体のコントロールをとることが考えられるかも知れません。