ハイブリダイゼーション

質問

現在卒論で遺伝子クローニングをやっているのですが、サザンハイブリ、コロニーハイブリがうまくいきません。ファルマシアのAlkPhosDIRECTを使ってやっているのですが、どうしてもノンスペ(ネガティブを含む全てのバンド）が出てしまいます。説明書の条件はハイブリ55℃、洗い55℃でしたが、ハイブリ60℃、洗い65℃まで条件を厳しくしてやりましたがどうしても駄目です。プローブは目的の遺伝子の部分配列の500bpをクローニング後、インサートを切り出し精製して標識しています。所属の都合によりＲＩは使うことができません。なにかよい打開策があれば教えてください。

回答No.1

yutaka007

文面から判断して、対策は簡単ですね。プローブですね。インサート切り出しの際に、ベクターのマルチクローニングサイトの配列が入っているか、ベクターそのものが混在していると考えられます。なので、それを含まないようにプローブ用のＤＮＡを作り直す必要がありますね。

キットの通りにやっていれば問題はありませんよ。きっと。キットの保存状態や使用期限が切れていれば話は別ですが。

インサートを切り出す時に、ホンの少しのベクター配列が入っていても問題はありません。positive と　negative　のシグナルの強さが違うので区別できます。

お礼

yutaka007さんのおっしゃるとおりのプローブでやりましたが駄目でした。
現在ハイブリを使わずＰＣＲでやることにしました。
いろいろ考えるヒントを下さってありがとうございました。参考になりました。