形質転換後の大腸菌コロニー

質問

形質転換後の大腸菌コロニーを大量培養したいのですが、振盪培養装置の量的制限もあり、必要なタンパク量まで培養バッチを重ねることにしました。種菌である大腸菌コロニーは培養のたびに形質転換をしなければならないのでしょうか。形質転換してから日数をおいての使用や継代は可能でしょうか。よろしくお願い致します。

回答No.2

HHHAAA_2011 · ベストアンサー

最も基本的なプロトコルは、精製した発現ベクターを適切な濃度で-30℃で保存しておき、
必要に応じて、大腸菌(大量に培養されるということなのでたぶんBL21(DE3)株とかかな
と推定します)を形質転換する、と書かれているとは思います。

ただ、実際にやった経験からいうと、
発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB(amp)液体培地で培養し、OD660nmが
0.5から0.6くらいになったもの3に対して、80%グリセロール溶液1を混ぜたもの
(最終グリセロール濃度が25%程度)を1mLずつエッペンドルフチューブに分注して
-70℃ディープフリーザーで保存しておき、必要時には、それを直接LB培地に
入れて培養する、という方法で基本的には問題なかったです。

プラスミドが抜け落ちると、よく言われますが実際にそういう現象にあたったことは
1回しかありませんでした。

寒天培地で保存は4℃の冷蔵庫で倒置して保存ということになりますが、これは
賞味期限？が短いです。1週間くらいが限度と思ってください。時間がたてばたつぼど
増殖が明らかに悪くなります。継代するなら3日とかくらいの頻度で移し替えて
いかないとだめかな、という印象です。あと、寒天培地をつくったときにまだ温度が
高い状態でシャーレに培地を入れて固めたときには、冷蔵庫で冷やしたときに
水滴がでてびしょびしょになることがあるので、注意してください。

いずれにせよ、

(1)精製したプラスミドは-30℃で保存する
(2)プラスミドを増やす用に形質転換した大腸菌株のストック(たとえばDH5αにプラスミドが
　入っているもの)も上と同じように、グリセロールストックで-70℃保存しておく。
(3)形質転換した発現用大腸菌もグリセロールストックで-70℃保存しておく。

とかしておくと、実験が早く進むと思います。

お礼

大変参考になり、非常によくわかりました。ありがとうございます。

回答No.1

larme001

通常の真核生物のタンパク質を大腸菌でプラスミドを用いて発現、誘導させたいという趣旨であれば、
基本的には発現用の大腸菌株に発現ベクターを導入し、発現が確認できたクローンを保存しておきます。使いたい前日にでも小スケールで増やしておいて翌日にスケールをあげて適当なところで誘導をかけて回収します。つまりタンパク質の発現は適度に「良好な」対数増殖期のはじめか真ん中ぐらいのところで誘導をかける必要があるわけで、それが満たされれば問題はないです。

　状況がつかみにくいのですが、要するに使わない間に小スケールで数日放置していたものを使いたいのでしょうか？不可能ではないですが、Ampなどは特にへたりやすいですし、培地も枯渇したり増殖が止まると死細胞が蓄積したりしてきてドロドロになるので開始スケールや温度にももよりますが、せいぜい2日ぐらいが限界かと思います。ただ、毎日ごく少量を新しい培地に植え替えてやればそういう心配はないと思います。たまに、発現が良好なクローンを保存していても凍結融解するとダメになるとかそういうのがあるので、そういうのを避けたい場合などはとくにそうやって維持しつつ、一部で誘導かけつつといった感じで問題なくできます。もちろん、ベクターが「抜け落ちる」とか「組み換えが起こる」とか大腸菌株によって起こりうるかもしれませんので凍結ストックは早い段階で一応作っておいたほうが無難ですけどね。一般的には、タンパク質誘導用の大腸菌でのプラスミドの長期保存は好ましくないといわれますし。　もちろん、実験に使う前にきちんと目的のタンパク質が出来ていることを泳動して確認するのでしょうし。

ちなみにベクターの作成用だとしても基本的には可能で、むしろタンパク用のそれよりも雑でも問題ないともいますが、一応ドロドロになる前に植え替えたほうがいいと思います。

補足

ありがとうございます。Agar plateに発育し、発現が確認できたクローンの同コロニーを寒天培地上で継代・保存を重ねても問題ないものでしょうか。寒天培地の適切な保存方法について、お教えください。よろしくお願い致します。