キトサナーゼ

質問

キトサナーゼの、1）菌体外に分泌される酵素である、2）菌体が有している内在プラスミド上にコードされる遺伝子である、3）2kb程度のEcoli－HindIII断片中に含まれる遺伝子であるということを確かめる実験方法をそれぞれ教えてください。1）については、基質にカゼインを用いた平板培地で菌体を培養し、キトサナーゼの分解によってコロニーの周辺にハローの形成が見られることで確認出来るであろうと検討はつきましたが、ほかの2問については分かりません。どなたか、教えていただければと思います。よろしくお願いします。

回答No.1

p0ntakun

学生さんかにゃ？

細かい部分は省略するけど、ペーパーテストならこんな感じでいいと思うよ。
（ペーパーテストでは原理の理解度をチェックするだけだから）
理系は忙しいけど、勉強ガンバってね！

【問題(2)】
菌体からプラスミドを取り出して、精製する。
（最近は便利な試薬キットも出てるね）
　　　　　　↓
そのプラスミドを持たない菌にプラスミドを導入し、形質転換する。
（塩化カルシウムを使う方法がお手軽かも）
　　　　　　↓
プラスミド導入した菌、導入していない菌（コントロール）を平板培地で培養して比較。
（キトサナーゼの検出できる培地を使ってね）

【問題(3)】
菌体からプラスミドを取り出して、精製する。
（最近は便利な試薬キットも出てるね）
　　　　　　↓
そのプラスミドを制限酵素（HindIII）で分解。
　　　　　　↓
分解物をアガロースゲル電気泳動して、ゲルから2kbpの断片を回収＆精製。
　　　　　　↓
その2kbpの断片を発現ベクターに組み込む。
　　　　　　↓
菌に発現ベクター（2kbp仕込み、2kbp仕込み無しの２種類）を導入し、形質転換する。
（塩化カルシウムを使う方法がお手軽かも）
　　　　　　↓
『2kbp仕込み発現ベクター導入菌』と『2kbp仕込み無し発現ベクター導入菌』(コントロール）
を平板培地で培養して比較。
（キトサナーゼの検出できる培地を使ってね）