gel band 精製を行うと、すごく回収率が悪いのですが、何かコツで

質問

gel band 精製を行うと、すごく回収率が悪いのですが、何かコツでもあるのでしょうか。

回答No.2

negigi · ベストアンサー

補足、ありがとうございます
残念ながら自分はそのKitを使ったことがないのですが、メーカーサイトのプロトコルを見る限りでは、普段使っている別メーカーのKitとほとんど同じ原理のようですので、分かる範囲で可能性を挙げてみます。

1. プロトコルにはAgaroseゲルについて書かれていますが、Agarでも同様の効率なのか確認していますか？自分はAgarゲルは使ったことがないので何がどう違うか詳しくは知りませんが、収率に何が影響しているか分からないので念のため。

2. ゲルは完全に溶けていますか？Capture Bufferの使用量は最適ですか？

3. Wash bufferにエタノールは加えてありますか？

4. Eluteする前にWash Bufferは完全に除去されていますか？
　　Wash bufferが残っていると、Elutionの効率が下がります。Wash bufferのflow throughを捨てた後、空のままもう一回遠心すると、よいかと思います。

5. Elutionは何uLで行っていますか？
　　もし10uLで行っているのであれば、一度50uLでやってみてもいいかもしれません。

いかがでしょうか。

お礼

2～4に関しては確認済なのですが、1,5は検討する必要があるかもしれないと思いました。
貴重なご意見ありがとうございました。

回答No.1

negigi

情報が少なすぎます。

何ゲルから何をどのような手順で精製し、
どのようにして回収率を算出したか

最低限、上記について記述してください

あと、周りの研究者には聞いたのですか？

補足

失礼いたしました。補足いたします。
まず、同じ研究室には経験者がいません。
先生もやっていません。
また、他の研究室には同じKitを使っている生徒がいないため、詳しくは
聞けていません。

Kitの種類はGFX DNA and Gel Band Purificatin Kitです。
また、TAEで溶解したAgar gelからDNAを精製しようとしています。
今は添付されているプロトコル通りに行っているので、インキュベート
の時間を長くした方が良いのかと思っています。
回収率は2μgのDNA量が精製した後は電気泳動してバンドが見えない程度に
まってしまいます。
ですので、計算はしていないのですが、ほぼ回収できていないのではないか
と思っています。
Kitは購入したばかりなので、付属のbuffer類がダメになっているとは考え
られません。

よろしくお願いします。