DNAシークエンスのアドバイスとコツ

質問

今年度から生物に転向して実験を開始したほぼ初心者です。
今、実験がDNAのシークエンスがうまくいかないという状態で実験が進行しなくて困ってます。
ですので、うまくいくためのアドバイスとコツを求めています。
シークエンスの結果としましては、全体的に‘N’が出てしまうような感じです。エタノールリンスでなくしている可能性もあるのですが、それ以外にどこか問題点がありそうでしたらしたら、アドバイスをください。お願いします(>_<)

使っているのは、BiｇDye　Terminator V1.1 Kitです。
手法的にはシークエンスのサイクルは30サイクルです。サイクルが終わったら、5.5 M NaOAcを1.5マイクロ 、EDTAを1.5マイクロ加えて、100％エタノールを加えて、遠心して上清を除いて、70%エタノールでリンスして、ドライさせたら、ホルムアルデヒドを加えて懸濁、ヒートショックと氷冷してます。そのあとで、シーケンサーにかけています。

また、100%エタノールを加えたあとで、遠心したら、白っぽい塊が生じるのですが、これは除いたほうがいいのですか？？
自分の中では、白っぽいものはNaOAcを加えることで余分なｄNTPとかが落ちているからな気がするのですが。。。。。

拙い感じですが、アドバイスをお願いしますm(__)m

回答No.3

noname#160718

シークエンスはDNAのクローニング、精製(プライマー等の除去)、サイクルシークエンス反応、精製(Dyeの除去)、電気泳動とステップが多いので、上手くいかない場合に原因を特定するのは容易ではありません。

　Nが多くて読めていないとのことですが、波形データでシグナルが無茶苦茶に出ていて"N"になっているのか、シグナルが極端に低くて"N"になっているのかで想定される原因と対処も異なってきます。

　PCR産物のシークエンスをされているのでしたら、最初のPCR産物を精製した際に電気泳動などで精製したDNAを確認されていますか？
　サイクルシークエンスにかけるテンプレート量が少なすぎても多すぎても、反応が上手くいかない可能性があります。テンプレートのDNA量は分光光度計でも測定できますが、アガロース電気泳動でマーカーのバンドの太さとの比較で行う方が良いと言われています。
http://www.hssnet.co.jp/2/2_3_2_1.html

　サイクルシークエンスとその後の精製については、ABIのサイトからマニュアルをダウンロードして熟読してから再挑戦した方が良いでしょう。
http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/home/index.jsp

　ABIのトップページから[テクニカルサポート]→[テクニカルアップデート]で各種マニュアルをダウンロードできます。BigDyeのv1.1のマニュアルもあります。
　マニュアルのダウンロードにはユーザー登録をする必要がありますが、所属や業務内容を入力するだけなので問題ないと思います。

　精製はエタノール沈殿でもちろん良いのですが、カラム精製の方が操作が簡便なだけミスが少なく、特に多検体処理をする時は予算などの状況が許せば使いたいところです。精製の良し悪しがシークエンスの成否を決めると言って良いくらい重要な行程ですし。

補足

お返事ありがとうございます。

ＤＮＡ量は、電気泳動して量を確認していますが、若干足りないＤＮＡ量だったので、サイクル数を増やしてやってみていたのですが、サイクル数を戻してみます。

ちなみに、ベクターに入っているＤＮＡをシークエンスしています。

精製に、カラム精製を使いたいのですが、残念ながら予算上無理なのです。エタノール沈殿のほうでがんばります。

基本的には、波形データーがめちゃくちゃなほうです。
シグナルが極端に低いほうもあるのですが、それは精製がうまくいっていないからだと思い込むことにしています。

回答No.2

geneticist12

白い沈殿はEDTAが析出したものです。EDTAが反応液によく混合されていなく、濃い状態でエタノールを加えてしまうと析出します。一度、析出すると溶けません。EDTA→NaOAc→エタノールの順に、加えるごとによく混合しましょう。
それと、マニュアルを見直して、各溶液の濃度や調製法、加える分量が間違っていないか確認してください。濃度が濃すぎたり、pHが違ったりしていませんか？

ver 1.1なら、20 uL 反応液に対して、80 uLの75 % イソプロパノール（塩類なし）を加えて沈殿するする変法もメーカーから提示されています（3.1には適さないとされている）。こちらを試してみてもいいでしょう。

>全体的に‘N’が出てしまうような感じです。

これだけでは、精製の失敗なのか、反応自体がうまく行っていないのかわかりません。プライマーや鋳型が違えば、同じように反応するとも限りませんし、手技による失敗の可能性もあります。キットにはコントロール用の鋳型(pGEM)とプライマーがついてきているはずなので、これでやってうまくいくことを確認してください。コントロールがうまく行くなら、失敗の原因は鋳型やプライマーの問題、うまく行かないのなら手技や反応液の劣化などの問題です。

補足

お返事ありがとうございます。

白い沈殿はEDTAが析出したものだったのですね。
次は順番と混合に注意したいと思います。

分量に関しては、研究室の方針で全体的に半分の量で行っているので、
分量にミスがあるのかもしれないです！！

先日アドバイスを書いた直後に行ったものでは、全体的にＮが出ているものと部分的に読めているが、途中にＮが頻繁に入ってしまう状態でした。

全体的にＮが入ったほうは、おそらく精製がうまくいっていないのでしょうが、もう一方はうまくｄＮＴＰが入らなかったためと考えてやるしかないですよね。

キット自体は見たことなく試薬を渡されただけなので、コントロール用の鋳型とプライマーの存在を知りませんでした。今度、先生に相談してみます。

回答No.1

otx

本当に、ホルムアルデヒドを加えているなら違うと思います。書き間違えでしょうけど。ホルムアミドですよね？

補足

お返事ありがとうございます。
私はホルムアルデヒドだと信じてました。

先生が‘ホルムアルデヒド’といって渡してくださったような記憶があります。とはいえ、先生がいまいち何言ってわかりにくかったということとうちの研究室のプロトコールは変わっていることが多いので、そんなものなのかと何も考えずに使っておりました。

明日、精製を行うので、ホルムアミドを用いてみようかと思います。