PCR法における「ホットスタート」について

質問

学生実験にてPCR法によるDNA断片増幅を行いました。その応用として、「ホットスタート」と呼ばれる作業があるという事がわっかたのですが、具体的にどんな作業かわかりません。一体どのようなこと何でしょうか？ご存じの方教えてください。

回答No.1

medi_info · ベストアンサー

低温や室温で増幅を行うと効率が悪くなったり、非特異的な増幅がおこなわれてしまうため、こうした欠点を補うために高温でＰＣＲ反応液の完全な混合を行うようにし、反応をスタートさせる方法です。

４種類の方法があります。

　（１）高温下で不足しているコンポーネントを追加する方法
　まずＰＣＲに必要なコンポーネントの一部（ＤＮＡポリメラーゼやＭｇＣｌ２など）を除いた反応液を調製し、次に高温下（70℃～80℃）で不足しているコンポーネントを追加することで完全なＰＣＲ反応液にし、反応を開始させる方法。この場合、サンプル数が多くなると操作が煩雑になり、サンプル間汚染が起こりやすいので注意が必要。

　（２）ワックスバリアー法
　常温では固体であるがＰＣＲ増幅の際に高温下融解するワックスを利用し、ＰＣＲ反応液を分離することによりホットスタートさせる方法である。ワックスによって、１回目のＰＣＲサイクルまで反応液は上層と下層に分離しているが、最初の熱変性段階のときにワックスは溶解し、上層と下層が混合し反応がスタートする。

　（３）ＤＮＡポリメラーゼのモノクローナル抗体を用いる方法
　耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対するモノクローナル抗体を利用してホットスタートを実現する方法である。この抗体は、低温ではＤＮＡポリメラーゼの働きをブロックしているが、高温になると熱変性して解離するため、ＤＮＡポリメラーゼの活性が復活し、ＰＣＲ反応が開始される。

　（４）加熱処理をすることで活性化するＴａｑポリメラーゼを用いる方法
　常温では不活性化型であるが、加熱処理（95℃、10分間程度）することで活性化されるＴａｑポリメラーゼの修飾体を用いてホットスタート法を行う方法。この酵素の活性化の原理についてはメーカーによって明らかにされていない。ただ、高温で活性化されることを除けば、従来のＴａｑポリメラーゼと同じ性質を有するので、アニーリング温度や、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰの濃度など、検討を要する反応条件は基本的にＴａｑポリメラーゼと同じ。

お礼

丁寧な説明ありがとうございます。大変参考になりました。

回答No.3

fujishiro

突っ込んで悪いんですが…「学生実験をした」のでしょう？「する」のではなく。
ちゃんとやんなきゃだめですよ！

それはともかく。「具体的にどんな作業かわかりません」…たぶん、何もしなかったんじゃないですか？原理は皆さんが書いているとおりですが…実際の作業は混ぜて機械にかけるだけですよ（笑）あとは機械が熱して冷やしてを繰り返して増やしてくれます。

お礼

PCRの原理はわっかたのですが、どうしても「ホットスタート」がわからなかったもので、、、。回答ありがとうございました。

回答No.2

kawakawa

ワックスバリアー法以外は，乱暴な表現ではＰＣＲに必要な酵素を引いたり足したりして反応開始温度を７０～８０℃或いは９５℃条件とする方法だと思っていただければよいでしょうネ。
ワックスバリアー法は上層下層をワックスで分断し，加熱してワックスを溶かして反応させるというものです。
ＤＮＡポリメラーゼ等を除去した反応液を７０～８０℃にしてから，必要な分画を加えてＰＣＲ反応液を完成させる方法。
高温で失活するモノクローナル抗体を加え，一定以上の加熱をまって反応を進める方法。
高温でのみ活性化する酵素を加えて行なう方法。
こういったものがホットスタートですが，遺伝子関連の実験手引書に詳細が載っていると思いますヨ。
以上kawakawaでした

お礼

回答参考になりました。近場の図書館（そこしかないんですけど）がイマイチなもので、関連書がほとんどないんです、、。回答ありがとうございました。