吸光係数について

質問

吸光度に関してですが、ランベルト・ベールの法則では、吸光度＝溶液の濃度×溶液層の厚さ×吸光係数
なのですが、この吸光係数にはどのような値が当てはまるのでしょうか？具体的にもらえるとありがたいです。よろしくお願いします

回答No.3

mogula · ベストアンサー

ちょっと質問の意図がわかり難いのですが、
測定した吸光度からサンプルの濃度を求めたい。
ということなのでしょうか?

と、その前にどうも質問者さんはモル吸光係数εを理解されていないようなので、簡単に説明しますと、fronterさんが回答しているように、1cmのセルに1mol/Lの溶液をいれて測定した時の吸光度がεです。そのため単位は、L/(mol・cm）と成ります。

今、質問者さんはサンプル濃度にモル濃度mol/Lではなく重量濃度μg/mlを用いているので、
・（平均）分子量を用いて濃度表記をモル濃度に換算する。
・モル吸光係数εではなく、単位重量あたりの吸光係数を新たに定義する（例えば、L/(g・cm）とか）
ことが必要になります。

次に、ランバートベールの法則を用いてサンプルの濃度を求める方法ですが、単位がモル濃度だとして話を進めますと、
先ず、正確に濃度を調整したサンプルを幾つか用意します。この時、吸光度が測定範囲（通常は0.01～2くらいの範囲）になるように濃度の異なるサンプルを準備します。
そして、それらを1cmのセルで測定すると、ランバートベールの法則より、濃度と吸光度が直線関係になるので最小二乗法を用いて直線の傾きを求めます。この傾きがモル吸光係数です。

続いて、未知試料（測定したいサンプル）を1cmのセルで測定し、得られた吸光度を先に求めたモル吸光係数で割れば未知試料のモル濃度が求まります。

もし、モル濃度ではなくて重量濃度(g/ml)で求めるなら、上記のモル吸光係数を単位重量あたりの吸光係数に、モル濃度を重量濃度に置き換えてください。

回答No.4

Kemi33

御質問がも一つ解り難かったんですが，「吸光係数をどうやって求めるのか？」という質問でしたら，#3 さんの回答にある様に，濃度既知のサンプルを実測して求めます。

　そうではなくて，#2 さんの補足に書かれた『DNAを測定したときに出てくる吸光度から濃度をを求める際、濃度はO.D.260の値×50μg/ml×希釈率で求められると思うのですが、これをランベルト・ベールの式に当てはめようとしたら、どのように考えれば良いのだろうか』が本来の御質問でしたら，次の様に考えて下さい。

　セル長 l [cm]，モル濃度 c [mol/l]，モル吸光係数ε[l/mol・cm] とすると，O.D.＝ε・c・l となります。

　これから，モル濃度 c は c＝O.D./(ε・l) [mol/l]となります。通常の測定では，セル長 l は 1 [cm] ですから，c＝O.D./ε [mol/l] です。

　ここで，お書きの核酸のεが必要になりますが，参考 URL に 260 [nm] 近辺の値がでています。平均すると約 10000 です。ですので，c＝O.D./10000 [mol/l] となります。

　ここで得られた c はモル濃度 [mol/l] ですからお書きの [μg/ml] に直すには分子量が必要です。これも参考 URL に出ていますので平均すると約500です。

　モル濃度 c [mol/l] と [μg/ml] での濃度 c' との関係は，

　c' [μg/ml] ＝ (c・500)/1000 [g/ml]
　　　　　　　＝ c・(500x10^6/1000)
　　　　　　　＝ c・5x10^5 [μg/ml]

　ですから，c' ＝ (O.D./10000)・5x10^5 ＝ O.D.x50 [μg/ml]

　後は希釈率をかけるだけでお書きの式になります。

参考URL：

http://www.promega.co.jp/cat/technical/17-u.html

お礼

ありがとうございます！！今ひとつ、頭の中でつながらなかったのですが、やっと理解できそうです。っというか、完全に私の理解不足ですね。親切なご回答ありがとうございました。

回答No.2

eyenes

具体的な値ですか？

そうですね、問題を解いてると大体分かってきますが、3000～20000くらいの値に収まることがおおいですね。

補足

すみません、質問が解りにいですよね。私が悩んでいることは、DNAを測定したときに出てくる吸光度から濃度をを求める際、濃度はO.D.260の値×50μg/ml×希釈率で求められると思うのですが、これをランベルト・ベールの式に当てはめようとしたら、どのように考えれば良いのだろうかと思ったのです。（やっぱり解りにくいでしょうか？）解説いただけるとうれしいです。

回答No.1

fronter

こんばんは＾＾

自分の分かる範囲で答えたいと思います。

「吸光度＝ε×l×c」がlambert-beerの法則ですね。

このεがモル吸光係数で、これは液層の厚さlが1cmで溶液の濃度が1mol/lの時の吸光度に相当するものがεになるわけです。

これが定義ですので問題に出されれば、εの数値は与えられるのではないでしょうか？？

補足

実際に、DNAを吸光度計を使って測定するとき、濃度（c）はO.D.×50μg/ml×希釈率で求められますよね？
これをランベルト・ベールの式に当てはめると。
O.D.=ε×c　で、c=O.D./εということになるので、
ε=50μg/ml×希釈率ってことになるのでしょうか？
うーん、基本的なことが判っていないようです。
すみません、回答お願いします。