HIF-1 alpha セルライセート調整について

質問

こんにちは。

サスペンション•セルからHIF-1 alphaをウエスタンで取りたいのですが
なかなかうまくバンドが出ません。

私の方法はハイポキシア•チャンバーを開けた後、直ちに細胞をスピンダウン、
メディウムを取り除いてそこに等量の１Xローディングバッファ(＋リパバッファ＋Protein inhibitor)を加えます。
それをピペッティングして溶かした後、２７Gの針で何回か細胞をホモジナイズして
それを９５℃でボイルします。
そしてそれをゲルに流しています。

抗体はBDバイオサイエンスを始め各社試していますがバンドが出ません。
おそらくライセートの調整になにかあるのではと思いました。

御存知の方がいらっしゃいましたら宜しくお願い致します。

回答No.1

overthisgraysky

「等量の１Xローディングバッファ」って細胞のボリュームと等量ってことですか？
もしそうなら蛋白質の濃度が濃すぎませんか？メディウムと等量ということでしょうか。
私は濃くても３マイクログラム／マイクロリットル以下になるように調節しています。
そうしないと溶けきらない蛋白質が沈殿するからです。

あとは。。作業は氷の上でやっていますよね？

とりあえず、ポジティブコントロールとしてウェスタンで他の蛋白（アクチンとか）は検出できていますか？

補足

さっそくのお返事どうもありがとうございます。

１X　loading bufferはセルペレットと同量という意味です。もちろん通常ではもっと薄めますが
色々論文調べたところ、HIF-1のウエスタンは40ug以上のものが多くありました。
アクチンはちゃんと検出できています。

通常のウエスタンのセルライセートの調整方法は問題なくできておりますので
HIF-1　alpha検出時のライセートの調整方法をご存知でしたら引き続き回答よろしくお願いいたします。