細胞培養について

質問

細胞培養について

2点教えて下さい。

1．　培地（DMEM）を吸引除去後にPBSを加え細胞表面を洗いますが
　　　　軽く揺するだけで良いでしょうか。また、時間はどのくらいでしょうか。

2．　上記のあと、トリプシンを1ml加え細胞を剥がす際
　　　　2～3分揺らしていますが、時間はこのくらいで良いでしょうか。

　時間や手技などについて調べたのですが様々で・・・。
　実際にやられている方にお聞きしたいと思いました。
　その他、注意点などありましたら教えて下さい。

　宜しくお願い致します。

回答No.3

larme001 · ベストアンサー

2での質問もしているようですので合わせて回答します。

1.基本的には、培養でしばらくたった後の不要な不純物や弱って接着しなくて死んでしまった細胞を取り除くことと、血清中に含まれるトリプシンを失活させる成分を除去することが目的かと思います。強くやりすぎると（特にはがれやすい細胞は）多少なりダメージになりますし、PBSで長時間インキュベートするだけでもある程度細胞ははがれます。というわけで、さっと2回ぐらいやればいいと思います。はがれやすかったり、目的によっては1一回そっとやる程度とかでもいいでしょう。

2トリプシンEDTAは細胞に少なからず毒性があるのでできるだけ少量で少し浸るぐらいでいいでしょう。ただ、これも細胞によってははがれにくい場合や、少量から増やしてきたりしてしばらく継代をしていない細胞の場合は、少し多めでもいいと思います。軽くゆすって全体をなじませてやったほうがいいですが、あまり激しく叩くのは良くないのでは？インキュベーターに入れたほうがトリプシン（酵素活性）がより働きますが、経験上入れなくても多くの細胞で結構はがれてきます。はがれやすいもので1,2分～はがれにくいもので5分ぐらいが目安ではないかと思います。　いずれにせよ、後できちんと適量のメディウムをいれてトリプシンを失活させてやることが重要かと思います。

培地などの保存温度ですが、基本的には良く使うものは（凍結融解が好ましくないため）4℃、しばらくつかないものは-20℃で保存し、細胞にあてるまえに湯浴等で37℃付近にしたほうが好ましと思います。まあ、私はトリプシンは温めてないですし、そこまで厳密に温度管理しなくてはまずい細胞も少ないとおもいますよ。

この辺のやり方は研究室の技法によって多少違うので、基本（細胞毒性とか、酵素をだめにしないとか）を守ればそこまでシビアにならなくてもよいと思います。あまり神経質になると、時間ばかりかかって実験時間がもったいないので。。。

お礼

1．それぞれの作業の目的が把握できれば、スムーズにできそうです。

2．トリプシンは、10ml（10cmシャーレ）の培地に対して1ml入れています。
　　かろうじて全体に行き渡るかな、という量です。

試薬の温度についてはそんなに神経質にならなくていいんですね。
確かに37℃に温めておいても、クリーンベンチの中で作業しているうちに
結構冷えているので、温めた意味あるのかな？と思っていました。

丁寧な回答をありがとうございました！

回答No.2

Ebonbon

私は現在、線維芽細胞と内皮細胞を扱っていまので参考までにどうぞ。

1．揺すっても揺すらなくても大丈夫です(両方やったことがありますが違いはなかったです)。PBSを加えたらすぐ吸引します。時間はおかなくて大丈夫です。
PBSを加えて細胞の表面を洗うのは培地に入っている血清を除くためです。経験上、血清が残っているとトリプシンの効きが悪いです。なので最低2回はPBSで洗浄してください。

2．時間は扱う細胞によって異なります。扱う細胞の説明書で時間を確認するのが一番いいと思います。あまり長いと細胞にダメージを与えてしまう可能性があります。私が扱っている線維芽細胞は2－3分で剥がれますが、内皮細胞は4－5分くらいです。

お礼

とてもわかりやすい回答をありがとうございました。

2．細胞によって適した時間が違うんですね。

まだ始めたばかりなので、いろいろな細胞について勉強したいと思います。
どうもありがとうございました！

回答No.1

yuno2006

私がES細胞の培養していたときの方法です。

1. いれるだけでいい。すぐ吸って構わない。その作業を3回繰り返す。

2. インキュベーターに入れて2分位。様子見ながら延長

PBSでの洗浄が1回だけだとトリプシンの効きが悪いことがあるので
3回はした方がいい結果が得られます。

おまけ
培地を吸引するときパスツールピペットの先端にイエローチップを
かまして使うとピペット先端からのコンタミが防げます。

お礼

さっそくの回答ありがとうございます。

1　揺らさなくてもいいんですね。洗浄は2回行っていましたが3回にしてみます。

2　インキュベーターに入れるんですね！やってみます。
　　ちなみに”様子を見ながら”とありますがどんな感じが目安なのでしょう。

培地の吸引にはディスポのピペットを使っているので
コンタミは大丈夫だと思います。ご心配ありがとうございます！

別件にて質問があり、再度立てましたので
よろしければまたお願い致します。