シグナル経路系の実験手法について質問です！！

質問

あるシグナル経路の実験の計画をしております。
過去の実験からタンパクAで細胞を刺激すると細胞内でタンパクB→タンパクCというシグナルが伝わります。
私は『タンパクB→タンパクC』の経路がタンパクDによって仲介されているかどうかをこれから調べようとしています。
この場合、タンパクBの阻害剤とタンパクDの阻害剤を用いてタンパクCの発現を確認するといった感じなのでしょうか。
また、その場合は『細胞にタンパクBの阻害剤のみ入れる場合』、『細胞にタンパクDの阻害剤のみ入れる場合』、『細胞にタンパクBの阻害剤とタンパクDの阻害剤を入れる場合』の条件でタンパクCの発現を確認するのでしょうか。
そしてこの実験はどのような実験手法が良いでしょうか（例えばWBやPCRなど）
すごい初歩的な質問で恐縮ですが、どなたか教えてください！！

回答No.2

Dr_Hyper · ベストアンサー

先ほどのものです。
siRNAは特異性が・・・というかたは多く居られますが、世界的に見ても避けては通れないスタンダードな実験だと思います。もちろんreviewerのなかにも特異性に関して信憑性がと決まり文句のように言ってくるひとはいますけどもね。
阻害剤は通常標的タンパク質のすべての機能を阻害するわけではありません。詳しく調べれば例えば、リン酸化経路の酵素のATP結合を阻害することによって・・・などと記述されていると思います。つまりそのタンパク質の一部の機能のみ（普通はもっとも大事なところ）を阻害することになります。

この違いは、B-CがDを介して相互作用する場合に、siRNAでDの細胞内の量を少なくしてしまうとB-C-Dの複合体は形成されませんが、Dの阻害因子ではB-C-Dの複合体は形成される可能性も出てくるわけですね。この阻害剤の結果と、たとえばCの阻害剤の結果を比較したときに、これも例えばですが、Cの阻害剤はなぜかこのB-C-D複合体の形成を阻害したとすると、たぶん最初に予想された結果が異なって出てきますよね。Dを阻害しても大丈夫だけど、Cを阻害したらシグナルが伝わらなかった。と外見上見える可能性もあります。
むろん様々な検証をすればこれらのことは分かってきますが、siRNAのみでも阻害剤のみでも肩手落ちになってしまうと言うことだけ補足いたします。

お礼

再びご回答いただきましてありがとうございます。
とても分かりやすくご説明頂いたおかげで理解することができました。
siRNAやノックアウトマウスの手法も含めて実験を計画したいと思います。ありがとうございました。

回答No.1

Dr_Hyper

これはなんかのレポートなのでしょうか？研究室のボスにこうゆうことをするから実験を考えて見ろといわれての質問でしょうか。
いずれにせよ、今の知識でいいのでもっと詰めて考えた方が良かったですね。
「発現を確認するといった感じなのでしょうか。」というように質問もおわってしまうのではなくて、
そこでの一寸した努力が一番ご自身が伸びる瞬間だと思います。。。。
と説教じみてきましたのでここまでにして。

さて、
書き出したらきりがないので一部分のポイントだけですが
「タンパクB→タンパクC』の経路がタンパクDによって仲介されているかどうか」
についてBとCの伝達経路にDが関与するかどうかは、培養細胞の実験系であれば、簡単にはDをsiRNAなどで細胞レベルでノックダウンするか、Dの（コンディショナル）KO mouseなどから得たMEFを使ってシグナルが伝達されるかどうかを調べればいいですね。Dが実際にどのように関与するかは、相互作用、局在、発現量などの情報をあつめて解き明かしていく必要があります。
あなたが書いているように阻害剤の実験も重要だと思いますが、阻害剤の特異性やDの分子機構実際に関与しているなどに注意を払う必要があります。

お礼

ご回答ありがとうございます。
すみません、怒られるのを覚悟で質問しました。
初めて実験を計画することになり、研究室に教えてくれる人もいないので途方に暮れて質問してしまいました。申し訳ありません。
やはり、siRNAやノックアウトマウスを使った方が良いですよね。
ただ、siRNAは必ずしも特異的ではないと聞いたことがあるのですが、本当でしょうか。
私の研究室ではあまりsiRNAを使っていません。でも、阻害剤を使って実験するよりは信頼性が高いということでしょうか。