RNA抽出について

質問

私は長年タンパク質専門で研究を行ってきたため、分子生物学は学生時以来なので大変困っております。
ラットの凍結組織(肝臓)からRNA抽出を行いましたが、うまくいきません。とは言え、同時に10本行ったらうち4~5本はOK、4本行ったら2本OK、と言った具合でいくつかは成功します。
キットはQIAGENのRNeasyPlusを使用し、凍結組織20~30mgに対し抽出液を600μl入れてポリトロンでホモジナイズし、gDNA eliminatorカラムも使用しています。中に入っているプロトコル通りであることも確認しました。組織の保存状態は悪くないです。うんと古いというわけでもありません。
研究室の人間に聞いても満足な返事が返って来ないので、こちらで質問させていただきました。経験がある方、アドバイス宜しくお願い致します。

回答No.7

tatoo · ベストアンサー

質問者さんは組織の保存状態についてわざわざ言及されているので、
その点は問題ないとして書き込ませていただきます。

私の感覚ですが、RNA抽出の過程にはものすごく強いタンパク質変性剤を使用しますので、
そのタンパク質変性剤の存在下では、まずRNAが分解されることはありません。
しかし、最終的にはタンパク質変性剤が存在しない溶液にRNAは溶けている状態になるので、
そのときに、それまでに取り除けなかったRNaseの活性復活、
もしくはその最後の溶液にRNaseがコンタミしていると最悪の結果になります。

それで私だったらまず疑うのは、最終的に溶かす水です。
これには少量でもコンタミするとRNAは壊れてしまうと思います。
もしそれを確認するのであれば、既に抽出されたRNAを質問者さんが使っている水で溶かして37℃で30分くらいおいた後、
電気泳動するとわかると思います。
この方法で使われている試薬等をチェックすると犯人がわかるときがあります。
ですが、タンパク質変性剤に含まれている場合はわからないかもしれません。

次に疑うのは、組織の量です。
確かにキット等では上限が記されているとは思いますが、試薬に少量コンタミしたRNaseより、最も多くのRNaseは組織由来のものであると私は思います。
多すぎるRNaseは最終的に残る可能性を大きくしてしまうと思います。
ちょっと組織の量を控えめにしてみてはいかがでしょうか。

あと、質問者さんが取ったRNAを泳動した場合、失敗と思われるものは全く何も泳動していないように見えるのでしょうか？
それとも、これが分解産物だろうなぁというスメアっぽいのも見えないのでしょうか？
もし、スメアも何も見えないというのならば、抽出行程のかなり初期の段階で壊れているか、
単に回収がうまくいっていないためであると考えられます。

回収については実際見ていないので何ともいません。
しかし、初期の段階で分解されるというのならば、やはり試薬のRNaseのコンタミをチェックするのがはやいかもしれません。
RNAがとれたりとれなかったりするのは、RNaseのコンタミが、なんと言うか、
うまくいくかいかないかのギリギリのところをさまようようなコンタミ具合で、
うまい人はいけるけどそうでない人は時々壊れるといったことなのかもしれません。
後はもう１つは、うまくいっている人と質問者さんが同時に同じサンプルでやることですかねぇ・・・。

乱文にて失礼します。

お礼

お礼が遅くなり、皆様方には大変失礼いたしました。
ようやく解決しました。
とっても悩んでいろいろ皆様のアドバイスに従って考えておりましたが、つまらないことが原因でした。

ここのところ、しばらく来ていなかった人が、ガラス容器にチューブを入れてRNA実験台に置きオートクレーブを忘れ、前に使ったアルミホイルがかぶっていたため、私はオートクレーブしたものと勘違いして使用していたことが判明いたしました。やっと復帰してきたため判明いたしました。

ただ、私は遺伝子実験には大変不慣れなため、皆様のアドバイスでいろいろと勉強になりました。皆様、本当にありがとうございました。

補足

とても詳しくお答えいただきまして、ありがとうございます。
試薬に関しては、同じ試薬を使って培養細胞からRNA抽出を行ってみたところ、培養細胞は充分量、全てのサンプルで回収できていましたので、やはり組織由来の可能性が強いかな…と思いました。ます組織量を検討してみたいと思います。
電気泳動では、うっすらスメアに見えるような感じがしますが、はっきりとはしていません。うっすらしているということは、初期段階から壊れ始めているのかもしれませんね…
ちょっと見えて来た気がします。ありがとうございます。
お礼は改めて後日…ありがとうございました。

回答No.8

rio2

主観かもしれませんがバイオアッセイの簡易キットでうまくいかない場合は、原点に返って古典的な方法を試みるとうまくいくことがしばしばあります。
特に各抽出試薬ではこのような印象を持っています。

total RNA抽出でしたら酸性フェノールとグアニジンチオシアネート、両性界面活性を含むキットではない単品試薬が国内では３つほど出ていますので、こちらで試験されることをお勧めします。

またRNAの分解を抑制する試薬も多数出ております。

ホモジナイズが不完全であることも疑われますが、肝臓ということですので比較的問題ではないかもしれません。

お礼

お礼が遅くなり、皆様方には大変失礼いたしました。
ようやく解決しました。
とっても悩んでいろいろ皆様のアドバイスに従って考えておりましたが、つまらないことが原因でした。

ここのところ、しばらく来ていなかった人が、ガラス容器にチューブを入れてRNA実験台に置きオートクレーブを忘れ、前に使ったアルミホイルがかぶっていたため、私はオートクレーブしたものと勘違いして使用していたことが判明いたしました。やっと復帰してきたため判明いたしました。

ただ、私は遺伝子実験には大変不慣れなため、皆様のアドバイスでいろいろと勉強になりました。皆様、本当にありがとうございました。

回答No.6

sevenless

その「うまくいっている○○さん」の後ろにぴったりくっついて１から１０まで真似してみましょう。

お礼

その「うまくいっている○○さん」にぴったりとくっついて教えてもらったことなので、今日、観察してみましたが全く同じことをやっていました…でも、それって大事な基本ですよね…タンパクの実験なら教える時私もぴったりくっついて1から10まで観察させますから…基本に戻ることが解決への第一歩ですね。

補足

（補足とお礼が逆になってしまいもうしわけありません。）
お礼が遅くなり、皆様方には大変失礼いたしました。
ようやく解決しました。
とっても悩んでいろいろ皆様のアドバイスに従って考えておりましたが、つまらないことが原因でした。

ここのところ、しばらく来ていなかった人が、ガラス容器にチューブを入れてRNA実験台に置きオートクレーブを忘れ、前に使ったアルミホイルがかぶっていたため、私はオートクレーブしたものと勘違いして使用していたことが判明いたしました。やっと復帰してきたため判明いたしました。

ただ、私は遺伝子実験には大変不慣れなため、皆様のアドバイスでいろいろと勉強になりました。皆様、本当にありがとうございました。

回答No.5

teru-arai

研究者の方ならおわかりかと思いますが、うまくいかないと言う質問には
答えのしようがありません

お礼

お礼が遅くなり、皆様方には大変失礼いたしました。
ようやく解決しました。
とっても悩んでいろいろ皆様のアドバイスに従って考えておりましたが、つまらないことが原因でした。

ここのところ、しばらく来ていなかった人が、ガラス容器にチューブを入れてRNA実験台に置きオートクレーブを忘れ、前に使ったアルミホイルがかぶっていたため、私はオートクレーブしたものと勘違いして使用していたことが判明いたしました。やっと復帰してきたため判明いたしました。

ただ、私は遺伝子実験には大変不慣れなため、皆様のアドバイスでいろいろと勉強になりました。皆様、本当にありがとうございました。

回答No.4

sevenless

１０個の肝臓をすりつぶし、１０本のＲＮＡを取ったのなら、そもそも組織がダメになっているという可能性もあります。採取してすぐに液体窒素で凍結し、ディープフリーザーに保存してあったのなら普通は数年経っても大丈夫ですが。

お礼

今日一日いろいろと確認と試しを繰り返しておりましたので、お礼が遅くなり申し訳ありませんでした。

保存組織はほとんどの物が信用できる人の手によって採取、保存してあったので安心していましたが、1つだけ別の人によって採取されたと思われる物が混ざっておりました。それはやはりどうしても抽出ができませんでした。そのサンプルに関しては、採取した時の状態が非常に悪いのかもしれません。
ありがとうございました。

回答No.3

otx

ひとつの肝臓をすりつぶし、10本のチューブに分け、そのうち４－５本はOKであると質問の内容を理解すると、
根本の実験試薬や器具は、RNAがとれる環境であるということであると想像します。もしそうなら、ダメだった５－６本は質問者様の実験操作が原因ということになるのです。
こればっかりは実際見ていないので、なんとも言えないです。
実際やられているご自分で些細なことでもチェックしながらやられてみてはどうでしょうか。

お礼

お礼が遅くなり、皆様方には大変失礼いたしました。
ようやく解決しました。
とっても悩んでいろいろ皆様のアドバイスに従って考えておりましたが、つまらないことが原因でした。

ここのところ、しばらく来ていなかった人が、ガラス容器にチューブを入れてRNA実験台に置きオートクレーブを忘れ、前に使ったアルミホイルがかぶっていたため、私はオートクレーブしたものと勘違いして使用していたことが判明いたしました。やっと復帰してきたため判明いたしました。

ただ、私は遺伝子実験には大変不慣れなため、皆様のアドバイスでいろいろと勉強になりました。皆様、本当にありがとうございました。

回答No.2

Kunishige

こんばんは。

モノがＲＮＡだけに、取敢えず根本部分の見直しは大丈夫ですか？
ゴム手袋・チップ・水・バッファ・容器・吸光度計で用いてるセル・・・等々。
慣れているからこそ、基本の地味なところで足を掬われている可能性はありませんか？
複数本行っていくつかは抽出できていることを考えれば作業技術自体は問題無いと思うので、
テクニック面以外から見直してみるというのはどうでしょう？

お礼

お礼が遅くなり、皆様方には大変失礼いたしました。
ようやく解決しました。
とっても悩んでいろいろ皆様のアドバイスに従って考えておりましたが、つまらないことが原因でした。

ここのところ、しばらく来ていなかった人が、ガラス容器にチューブを入れてRNA実験台に置きオートクレーブを忘れ、前に使ったアルミホイルがかぶっていたため、私はオートクレーブしたものと勘違いして使用していたことが判明いたしました。やっと復帰してきたため判明いたしました。

ただ、私は遺伝子実験には大変不慣れなため、皆様のアドバイスでいろいろと勉強になりました。皆様、本当にありがとうございました。

補足

アドバイスありがとうございます。

私、タンパク質専門でやってきているので、念には念を入れて「昨日○○さんが使ってRNA抽出できていた」物だけを使って今日抽出を再度してみましたが、やっぱりダメでした…なんでだぁ～？(泣)を叫びつつ…

解決したら、改めてお礼させていただきますね…

回答No.1

otx

失敗とは具体的に何のことでしょうか？
RNAが分解しているのでしょうか？収量が悪いのでしょうか？
どこまで、何を確認しているか示されるとアドバイスしやすいです。

補足

失敗とはまったくRNAが取れていない、という意味です。説明不足ですみません。吸光度から計算してもRNAは全く取れていない、電気泳動してみてもバンドなし、という具合です。
取れていないのは確かですが、途中で分解してしまっているのか、ただ取れていないのかは不明です。