CTAB法におけるクロロホルム／イソアミルアルコールの意味とは何ですか？

質問

初歩的な質問で申し訳ないのですが、CTAB法にてDNAを抽出するさいに用いられるクロロホルム／イソアミルアルコール液はどの様な目的で使われているのでしょうか？フェノールが入れば納得できるのですが、フェノールは使っていないので、なぜかわかりません、誰かご存知の方教えてください。

回答No.3

geneticist12

補足します。

塩とCTABだけで、タンパク質は不溶化しているはずですが、おそらくそのまま遠心しても上清からきれいに分離しにくいのでしょう。クロロフォルムを加えることで界面にきれいにまとまってくれるからだとおもいます。
プラスミドをアルカリ/SDS法でとるとき、塩を加えてタンパク質・変性DNA・SDSの複合体を沈殿させますね。でも、そのまま遠心しても管壁にくっついたり、水層にかけらが混じったりして、きれいに水層を分離しにくいことがあります。これを防ぐためのTipsとして、少量のクロロフォルムを添加するというのがあります。こうすることで沈殿を底の方のクロロフォルムとの界面にきれいに集めることができます。これと同じことではないでしょうか。

CTAB法はタンパク質に加えて多糖類も効率よく除去できるので、多糖類の多い植物や菌類、細菌類からDNAを抽出するのに良く使われます。
フェノール/クロロフォルムはタンパク質を除くのに優れていますが、多糖類には効果が望めません。クロロフォルムを加えないフェノールだけだとある程度、多糖類を除去できます。ただ、フェノールだけだと、水層との分離が若干悪いこと、短いかったりA-richな核酸（特に一本鎖）がフェノール層に入りやすいことなどから、一般的な除タンパク質の目的ではクロロフォルムと混ぜて使うことが多いです。

お礼

非常に参考になるご回答ありがとうございました！！

回答No.2

geneticist12

クロロフォルム自体には除タンパク質の能力はほとんどありません。せいぜい脂質が除けるくらいです。ふつうクロロフォルム抽出の目的は、フェノール抽出で除タンパク質をした後、水層に溶けたフェノールを除くために使います。

CTAB法でDNAを抽出する原理は、高塩濃度でCTABを加えるとタンパク質と多糖類が不溶性の沈殿になることを利用しています。これら不溶化した夾雑物をクロロフォルム抽出で分離しやすくするのです。

クロロフォルム抽出に使うクロロフォルムには1/25容のイソアミルアルコールを添加するのがふつうです。添加しなくても効果自体は変わらないのですが、疎水性が高すぎて水層との界面に強いメニスカスを生じ、水層が球のように丸まってその周りをクロロフォルムが包み込むようなかんじになって、水層の吸い出しが困難になります。

補足

ご回答ありがとうございます、つまりCTAB法でのクロロホルムは、フェノールの様に使って蛋白除去のためではないということでしょうか？蛋白除去であれば、フェノールを使えばいいのに、と思っていましたが、それであれば納得できるきがします！

回答No.1

cilantro

クロロホルムはタンパク質を変性させ、沈殿させるために使用します。DNA源によってはその他の夾雑物の抽出効果も期待できると思います。

イソアミルアルコールは攪拌時の発泡を抑える効果があります。

お礼

クロロフォルムはフェノールが水層に溶けるのを防ぐという役割しかないと思っていました。クロロフォルムで調べると幾つかご回答していただいた内容の記述をみつけることができました、ありがとうございました！！