酵素が樹脂にくっつかないんですよ～(*_*;)

質問

今ある酵素を原株から精製してるんですけど、陰イオン交換・陽イオン交換・ハイアパ・疎水樹脂っていう一般的な樹脂に通したんですが、何にも全くくっつかないんですよ。
　もちろんイオン交換では安定範囲でpH変えて（陰イオンではpH上げて、陽イオンではpH下げてって感じで）るんですがダメで、疎水でも硫安濃度変えたりしてみたんですがやっぱダメなんですよね。。。これってほんとにタンパク??って感じなんですが、間違いなくタンパクなことは確かなんですよね。。。
　挙句の果てにゲルろ過でも全然分けられないんですよ。これはおかしいってことで色々検討した結果、細胞破砕片みたいな茶色い成分に酵素がくっついてるんじゃないかって思ってきたんです。なので、細胞破砕片から酵素をはがさないといけないんで、界面活性剤なんか試してみたんですが、どうもよろしくないんですよね。クルードなんかオイリーな感じもするし、何かしらの前処理必要なのかなって思案を巡らせてみたりもしてるんですが。。。どうしたら樹脂にくっつけれるんだー(*ロ*)と五里夢中の私に知恵を貸してくださいm(_ _)m

回答No.3

mayee

ますはクルードを　がんがん超遠心にかけて完全に可溶化画分にしてみたらどうでしょう。

それからこれは念のための確認なのですが、カラムにアプライしたサンプルの量は適当でしょうか？
イオン交換カラムは最大許容量蛋白量の5分の1以下（高濃度にすると吸着が悪いです。許容量を超えると吸着しません。）、ゲルろ過カラムはカラムボリュームの5％以下くらいの液量（可溶化していれば濃度は関係なし、アプライするボリュームが少ないほど分離が良いです）で最初は始めるのが良いと思いますよ。

またカラムで処理するためにbufferの組成を変えたりしていると思うのですが、クルードの段階で可溶化していてもbufferを変えたとたんに沈殿したりすることもありますよ。

それから、しっかりプロテアーゼ阻害剤をいれておかないと目的の物がこわれてしまいます。精製の悪いサンプルだと思っていたら分解してブチブチにきれたあとの残骸だったということもありましたよ。

初めて挑戦するタンパク質はとても難しいですね。
なるべくアミノ酸配列、等電点、分子量などの情報を得た方が作戦が練りやすいです（練ってもだめなことも結構あるんですが・・・・）。

補足

アドバイスありがとうございますm(_ _)m 超遠心ガンガンかけてみます♪

サンプル量ですが、イオン交換については小規模検討段階ですし、あんまり気にしてないです（>ё<)アプライ⇒Wash⇒高塩濃度で一気に溶出って感じでやってます。ので、ちょっとでもくっついてたら溶出画分に活性あるよね（?_?) あとゲルろ過は5%以下にしてます。

たしかにBuffer（pH）変えたりすると失活しちゃったり等電点にビンゴして沈殿しちゃったりしますよね。だけど可溶性に活性あること確認できてるんですよ～。。。

あとPMSFも最初に添加してセリンプロテアーゼを阻害してます。４℃で数日間置いても特に分解されてるような感じはないんですよね。

ほんと意味わかんない質問ですみませんm(_ _)m

回答No.2

uhitomi

上の方が回答しているようにやっぱり不溶性画分にタンパクがきているのではないでしょうか？そうであれば、原株の培養方法の検討とかも必要と思います。ゲルろ過で分けれないことはまずないはずですし。そもそも、酵素が存在するかどうかどうやって判定しているのでしょうか？実は酵素活性の測定法が怪しくて、別の酵素の活性を測ってたとかそういうことはないですよね。また、非吸着でも条件さえ良ければある程度タンパクの精製はできると思うのでそれほど悲観することはないと思います。あと、どういうタンパクか分からないので具体的に答えられないのですが、アフィニティーカラムも検討してみてはいかがですか？私もある酵素の精製を原株から行っている学生ですが、なかなかうまくいかないですよね（>.<）

補足

ご回答ありがとうございますm(_ _)m
　先ほどNo.1の方にも補足を投稿させていただいたんですが、どうやら可溶性画分にきてるみたいなんです。ただ、培地成分や培養条件はもっと検討しなくちゃと思ってるところです。
　ところで酵素かどうかですが、クルードの状態ですが一般的な酵素科学的な性質は検討してみました。温度とかpHとか基質特異性、金属要求性etc。。。その結果、ちゃんと温度をかけたりpHを変化させると一般的な酵素の性質を示しますし、界面活性剤でも失活します。あと硫安で塩析もしました。なのでおそらく酵素かと　　　(；・∀・)タタブン。。。あ、あと測定法はごく一般的なので大丈夫かと。。。
　非吸着で結構効率よく夾雑除けたらいいんですが、SDS-PAGE的にはあんまり・・・なんです。
　使えるものがあるかどうかわかりませんが、アフィニティー検索してみます！！uhitomiさんも精製がんばってくださいね！！

回答No.1

MIYD

たんぱく質精製はあまりちゃんとやったことが無いのですが、

最初の時点でアグリゲートして不溶性画分にきているのではないことは確認できているのでしょうか。

ゲルろ過の前後での酵素活性(もしくはWBでの検出)がどの画分にきているのかは確認されているのでしょうか。
ゲルろ過で分けられないというのはvoid volumeに出てくるという意味でしょうか。
それとも落ちてこないという意味でしょうか。

参考URL：

http://biochem2.umin.jp/contents/Manuals/manual01.html

補足

ご回答ありがとうございますm(_ _)m
　最初の時点では活性が可溶性画分で測定できてるんで可溶性にきてると思います。不溶性画分にきてないかどうかは、巻き戻したりして確認したわけではないですし、SDS-PAGEなんかして確認もできないので（原株なんで発現量も少ないですし、なんせ分子量すらわかってない酵素なんですよ(*_*))はっきりとはわかんないです。
　ゲルろ過で分けられないのは、結構汚ーい酵素液流してるんですが、1ピークになっちゃうんです（質問で書かせていただいたように茶色い成分と一緒に）。。。ブルーデキストランとほぼ同じ位置なんですよね。もちろん樹脂の詰まり具合が問題というわけでもなく（ちゃんと詰め替えたし、HPLCでも同じ結果・・・）、このピークに活性もちゃんとあるんですよ(*_*)あーほんとに ・゜(PД`q。)・゜ドウシタライイノってかんじです。