ペクチンリアーゼの測定法

質問

ペクチンの分解酵素である
「ペクチンエステラーゼ」・「ペクチンリアーゼ」
・「ポリガラクツロナーゼ」
の能力を測定したいと思います。

ポリガラクツロナーゼは
ソモギ-ネルソンの還元糖定量で求め、

ペクチンエステラーゼは、
アセトンを加えた反応液を硫酸で停止させ、
Abs.620で測定する方法があったので試しています。
原理は未だ判りません、
他に分析法があれば教えてください。

ペクチンリアーゼは、
ポリガラクツロナーゼと測定上の区別が
付きにくく、測定法で迷っております。
ウロン酸の構造が崩れるようなので
ウロン酸を測って差があれば
ペクチンリアーゼがあると思っていいのでしょうか？

回答No.2

96R · ベストアンサー

Milner-Avigad法の文献です。
Y.Milner & G.Avigad, Carbohydr.Res., 4, 359-361, 1967.

ペクチンリアーゼの件ですが、エタノールに251nmの吸収があるとはどのようなことでしょうか？？
エタノールには紫外領域に吸収ピークはありませんので全く問題になりませんよ。
培養液中の吸収はブランクにも培養液を加えることで相殺されますので問題にならないと思います。

ちなみにPGの活性測定には、ペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼの活性も混入して測定されますのでご注意を。

補足

文献の紹介ありがとうございます。
ちょっと近間になさそうですが、探してみます。

エタノールの件は私の勘違いでした。
ペクチンエステラーゼの有無を分光光度計で
測定出来ないかと探しているのですが
よく読まずに早とちりしたようです。

> ちなみにPGの活性測定には、ペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼの活性も混入して測定されますのでご注意を。

判りました。
各々を区別することは難しそうですね。

回答No.1

96R

ポリガラクツロナーゼ活性ですが、基質が酸性糖であるため、Somogyi-Nelson法を使ったアルカリ溶液中での測定はできません（測定値が不安定）。酸性還元糖の測定法であるMilner-Avigad法を用いて下さい。

ペクチンエステラーゼは、生成したエタノールを定量する方法ですね。その他に反応の進行に伴ってpHが低くなりますので、既知濃度のNaOHで常時滴定し、単位時間に消費したNaOH量からも活性が測定できます。この際、反応液に緩衝液は使えませんが。

ペクチンリアーゼは、反応によって非還元末端糖のC-4とC-5の間に235nmの吸収を示す二重結合を作ります。これを測定すれば簡単に活性が測定できますよ。

補足：ペクチンリアーゼはウロン酸の構造は壊しません。また、ウロン酸（ガラクツロン酸）の部分にも作用しません。非還元末端がメチルエステル化されたガラクツロン酸（中性糖）に作用します。
ガラクツロン酸に働くリアーゼは、これと区別してペクテートリアーゼと呼ばれていますよ。

補足

丁寧な回答を頂きありがとうございます。

ポリガラクツロナーゼのMilner-Avigad法ですが、
測定方法の参考文献など教えていただけないでしょうか。

ペクチンリアーゼの235nm測定ですが、
ペクチンエステラーゼが混在している可能性がある場合、
エタノールに251nmの吸収があるため
吸光度法は使いにくいのでしょうか。
酵素液に菌の培養液も含まれていますので。