HPLCでの有機酸測定について
生体サンプル(盲腸および糞中)の有機酸の測定(特に乳酸およびコハク酸)をしたいと思っています。
図書館で調べたり、抽出方法などを考えて測定しているのですが、残念ながら知識がほとんどなかったりするので、測定結果も芳しくありません。
pubmedなどは探したのですが、イオン交換クロマトグラフィーでほとんど測定されています。
私は逆相クロマトグラフィーで東ソーのODS100というカラムを用いて測定しようと思っているのですが、なかなかうまくいきません。
測定条件・サンプル処理法についてアドバイスや参考となる文献を教えて頂きたいと思います。なお、下記に現在の測定条件を書いておきます。知識のなさ故に、全く見当違いの方法でやっているかと思います。
優しく突っ込んで頂けると助かります(>_<)
現在の測定条件:移動相-0.1 %リン酸 , 検出波長-210nM
サンプル処理法:
1 サンプルを純水にて抽出して遠心分離
2 上清に1N過塩素酸 200μL入れて蓋をして加熱し、タンパク除去
3 ふたを外して加熱し、揮発性物質の蒸発させ、遠心分離
4 上清にクロロホルムを入れて脱脂質し、遠心分離し、クロロホルムを除去
5 上清ヘキサンを入れ、さらに脱脂質し遠心分離
6-1 上清をHPLCに注入(感度が低いながら、分析可能)
感度を上げるため、濃縮乾固を行いたいので、実際は
6-2 上清に0.2N NaOH/MeOH 1mLで塩化して濃縮乾固
7 純水で溶解してHPLCで注入(これだと、うまく分離できずピークが検出できない)
というやり方です。
細かい事でも良いので、突っ込みor参考図書・文献があれば、宜しくお願いします。
お礼
ありがとうございました。 波長は260nmですね! 他に移動相などの作成方法とか知っていますか?? 経験ありましたら教えて頂けると助かります。