パルスチェイス・免疫沈降法について
論文を読んでいるのですが、パルスチェイス実験についてわからなくて困っています。酵母内での目的タンパク質(免疫沈降のためHAタグ付き)の発現量を見るために、パルスチェイスと免疫沈降を行っているようです。
論文を読んでわかる大まかなプロトコールは以下のようです
(1)細胞をExpre35S35Sで10分パルス(35Sメチオニンと35Sシステインで標識)
(2)20mMのメチオニンとシステインを含む培地でチェイス
(3)細胞を破砕
(4)anti-HA抗体による免疫沈降
(5)SDS-PAGEとfluorographyで解析
とあります。
疑問点
・パルスのあとに(2)の操作でメチオニンとシステインを添加するのは何 故でしょうか?チェイスという操作が具体的に何をするのか教えてい ただきたいです。
・(5)の操作でSDS-PAGEを行うのは理解できるのですが、fluorographyで解析とはどういうことでしょうか?35Sを蛍光で見ているということなんですか?
・そもそも目的のタンパクを見るために、35Sで標識する必要があるの ですか?免疫沈降だけでは駄目なのでしょうか?
非常に困っているので、疑問点が一つでも解決して頂ける方はお願いします。
お礼
お礼が遅くなり、申し訳ありません。 詳しくご回答下さり、ありがとうございました。