吸光度測定と酵素活性測定法

質問

化学の実験で乳酸デヒドロゲナーゼを280nm吸光度測定したらほとんど検出できなかったのですが、酵素活性では測定できました。

これは、つまり酵素活性測定法の方が感度が高いということなのでしょうか？また、特異性の高い測定法はどちらなのでしょうか。周囲と話し合ったのですが、
A.酵素活性測定法の方が特異性が高いという側の意見
→酵素は基質特異性があるから、特異性を示すのはこっち

B.280nm吸光度測定法の方が特異性が高いという側の意見
→280nmは芳香環をもつ物質に特徴的な吸光度なので、特異性を示すのはこっち

という意見がでて、分からなくなってしまいました。ご存知の方がいらっしゃったらアドバイスいただけないでしょうか？？宜しくお願いいたします。

回答No.2

aka_tombo · ベストアンサー

蛋白のＵＶ吸収は一般的なものです。標準として例えばアルブミンを使うとするとアルブミンとしての濃度が求められます。
この検出限界以下の酵素量で酵素活性が認められた、と言うだけの事で、特異性と言うのがどういう意味かわかりませんが、基質、生成物から論じないと話がまとまらないのではありませんか？

質問者様は酵素活性を知りたいのか、タンパク量を知りたいのか、どっちでしょう？

生成物を測ったのであれば、基質特異性の話にできますね。また、基質の減少という形でも論じ得ますが、今回の質問内容はどちらでもないようです。

補足

回答ありがとうございました！！

私が実験で知りたかったのはタンパク質量です。分子量マーカーとしてカタラーゼやBSA、ペルオキシダーゼなど５つの物質の吸光度等を計測したんです。それで、LDHの分子量を求めよう、という実験をしたんです。その際、吸光度測定法と酵素活性測定法の両方を行ったのですが、吸光度測定ではほとんどLDHは検出できなかったのですが、酵素活性では検出できたんです。

この結果を踏まえて、どちらが特異性が高い判定法なのか考えよ、という問いを出されて、今回こちらで質問しているところなんです。

回答No.5

c80s3xxx

実験の概要が示されなかったので，回答も無駄足を踏んだ感があります．．．

まず，280nm 付近の，芳香族アミノ酸残基に起因する吸収は，たいがいの蛋白で見られます．理由は，一次構造上，芳香族アミノ酸残基を持たない蛋白はむしろ珍しいからです．メジャーなのはコラーゲン系蛋白くらいじゃあないかと．

混合物にどのくらいの割合でLDHが入っていたのかはわからないのでしょうか．
ゲル濾過で分取して，UV で見えないとなると，通常は酵素活性を測らないかもしれないくらいですが．まあ，全フラクションで測って，そういうクロマトグラムを取るという実験の仕方もありますが．

「基質特異的な反応」を使って LDH 活性を検出してるのですから，それは「LDH に対しては特異的な検出法」といえるでしょう．酵素反応による増幅効果で単純な UV 吸収より高感度に測れるということはあります．

回答No.4

aka_tombo

２です。
「特異性」という言葉の使い方に問題があるように思います。酵素の世界ならば「基質特異性」と解釈するのが多いと思いますが、ご紹介の内容ならば「どちらのほうが酵素の検出感度が高いか」の考察しかできないように思うのですが。
280nmの吸収は芳香環では特異かも知れませんが蛋白で見れば普遍です。

補足

回答ありがとうございます。

280nmの吸収は芳香環に特徴的に起こる吸収作用なんですよね??
【蛋白で見れば普遍】とおっしゃっていらっしゃるんですが、それはどういう意味なのでしょうか??蛋白質全般で280nmの吸収が起こるという事なのでしょうか??

回答No.3

c80s3xxx

分子量という言葉の使い方が間違ってます．分子量は「分子の量」という意味ではありません．また「分子量マーカ」という言葉の使い方も間違っています．分子量マーカはあくまで分子量を知るときに使うモノで，SDS-PAGE とか GPC とかでしか意味がありません．単なる吸光度測定では意味不明になります．

ところで，酵素活性というのは，タンパク量が同じなら同じになるという保証はありませんよ．変性酵素は活性が落ちますから．したがって，活性は活性，量は量できちんと区別して扱わなくては．

補足

回答ありがとうございます。
説明が不十分で、矛盾した記述が多かったですね、ごめんなさい！

今回、分子量マーカー５つとLDHの混合物をゲルろ過したんです。その時に吸光度を測定しました。分子量マーカーのうちBSAとカタラーゼ２つは280nmで吸光度を測定できたのですが、分子量がその付近の大きさにあるはずのLDHが280nmでは吸光度測定できなかったんです。
しかし、NADHの吸光度では測定できました。（これが「酵素活性測定」の意味だと思うんですが;;）

この事より、どちらが感度が高い判定法なのか、また特異性が高い測定法なのか、というのを知ろうという実験なんです。

説明不足・知識不足で大変申し訳ありません！

回答No.1

c80s3xxx

Bの方法はLDHじゃなくても引っかかりますが．
つーか，たいていの蛋白は280nmあたりに吸収が出ます．
例外はコラーゲン系蛋白くらいでは?

あと，日本語としての「特徴的」と「特異的」の違いを考えるのも吉かと．

お礼

回答ありがとうございます！

さっそく、「特徴的」と「特異的」、意味の違い調べてきました。
ちょっとあやふやで感覚的にしか理解できなかったのですが、やはり意味合いが違いますね。