joyjoyjo の回答履歴

ラージスケールでDNAを回収したいのですが、回収量がものすごく少なく(最後にTEに溶かして保存するのですが、そのTE量が30μl程度)、回収したものを電気泳動で確認するとスメア状になってしまいバンドを確認することができません。ミニプレップの時はキレイにバンドが確認でき、それからラージスケールを行っています。 LB100mlに対して大腸菌培養液を1ml入れていました。その量が少ないのかと思い、先に10mlLBで培養したものを100mlに移して本培養しています(培養時間は17時間程度)。それでも回収量が多くなることがないし、電気泳動で確認してもうまくいっていません。 何か解決策があればお願いします。

以前1629941で制限酵素処理について質問させていただいたものです。その後 約3kbpのpBluescript II sk (+)のmcsをEcoR1,Xho1で切断し、EcoR1,Xho1で切断した約1.6 kbp「プロモーター＋ネオマイシン耐性遺伝子＋polyA」断片を挿入したいのですが、全くコロニーができません。（LB培地＋Ampにて）（ベクター、インサートともにゲル抜きしその後フェノール抽出した） ライゲーションの系はSDW：4.4マイクロリットル 10×T4buffer：1マイクロリットル 10ｍMdATP：１マイクロリットル インサート（190ナノグラム/マイクロリットル）：1.6マイクロリットル ベクター（182ナノグラム/マイクロリットル）：1マイクロリットル T4リガーゼ：1マイクロリットル もうひとつの系はインサート2マイクロリットル（SDWは4マイクロリットル） 16℃で14時間 そのライゲーション産物10マイクロリットルを100マイクロリットルのコンピテントセルに入れました。 pBluescript II sk (+)をコンピテントセルに入れる技術はあります。 制限酵素処理後、形質転換までに他にすべき操作があるのか? 根本的にどこか間違っているのか? やり直すとしたらどこからやり直すべきなのか? 教えてください。 今回使用した酵素、buffer全て新しく購入したものです。 よろしくお願いします。

スリーピースライゲーションを行い制限酵素処理（Nde I/BamH I)で確認したところ、目的の断片以外にもうひとつ断片がでました。この制限酵素でベクター、インサートと共に切れる場所はないので、困っています。原因はなんでしょうか。

今、DNAの塩基配列を読もうと試みているのですが、 全く読めません。 今回よみたいにはコスミドで約40kbほどあります。 系は、12μlに、コスミドDNA200ng/mlと、 プライマーが3.5pmolが入っています。 プライマーはＴ3とＴ7です。 これが読めないと先に進めない為、困っています。 一応、DNA量を数倍にしてやってみたりもしたのですが うまくいきませんでした。 何かいい方法があったら教えてください！！